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标题:【求助】Bac-to-Bac 表达系统转染实验求助

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发表于 2014-3-10 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Bac-to-Bac 表达系统转染实验求助


各位同行, 我目前在用bac-to-bac表达系统表达几个蛋白,但转染实验老是不成功.转染后大概5天都没有病变发生,重复实验也是同样结果.请问各位同行有没有遇到类似的问题?如何解决?谢谢！
(目前实在是没其他办法,就把第一代上清加到第二代细胞里,但貌似也没有什么变化) .
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发表于 2014-3-10 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 重组Bacmid鉴定纯化的怎么样？
2. Cellfectin是在有效期吗？baculovirus的plaque assay做了吗，效价如何？
3. WB做了吗？有没有目的蛋白表达？
4. 整个bacmid纯化，转染过程有正对照吗？
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发表于 2014-3-10 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 coolcool 的帖子

你好！
谢谢你的回复！
1. 我的bacmid是用M13引物进行鉴定，扩增出了预测大小的片段。现在已经在负20度保存了几个月了，应该不会降解吧。
2. cellfection为新购买的，到明年才过期，所以转染试剂应该是没问题的。
目前连转染都没成功，所以后面的蛋白的都还没做到。转染的步骤就那么几步，所以一直不清楚问题出在了哪里。前几天做了个荧光蛋白的对照，但没观察到荧光出现。
因为bacmid很大，所以我混匀bacmid和cellfection的时候就是用枪头吹打几下，这会影响bacmid和cellfetion形成复合体吗？
另外还请教下：细胞代数会影响转染效果吗？我的sf9大概到了25代左右。听说刚复苏的细胞会比较好转染。
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发表于 2014-3-10 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. bacmid应该不会降解。应该是用专门提取大质粒的试剂盒吧？质粒的完整性和纯度鉴定了吗？有没有有机溶剂和盐分掺入？
2. cellfection应该没问题。
3. “混匀bacmid和cellfection的时候就是用枪头吹打几下”应该可以，也可以轻弹管壁混匀。bacmid和cellfection incubation time enough?
4. 复苏的细胞会比较好转染。但不是决定性因素。
另外，“荧光蛋白的对照，但没观察到荧光出现”。荧光蛋白是从pFastBac来的重组bacmid吗？
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发表于 2014-3-10 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的bacmid是用自己配的试剂抽提的，最后用无菌水溶解。请问你用什么方法检测质粒完整性？我跑了电泳，但大质粒都是留在孔里的一条亮带。孔外也有质粒条带，但肯定不是bacmid。
我的bacmid和cellfection孵育时间是20min，应该是够了的。
我转的荧光质粒就是EGFP，不是bacmid，就是想验证一下我的转染试剂和方法是可行的。但目前看不到荧光。
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发表于 2014-3-10 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

What is your reagent? How did you do your bacmid extraction? Are you aware of the difference between big and small plasmids? If you run enough time, bacmid even e.coli DNA will run out of the well.
20min may not be enough. Isn't that at least 45min from the protocol?
What is the plamid for EGFP expression and what is the promoter driving EGFP? If you have the whole kit why not use the positive control to check your procedure from bacmid recombination to transfection and expression?
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发表于 2014-3-10 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我怀疑留在孔边的是bacmid，跑在前面的是菌体里残留的pFastbac。
protocol里建议孵育时间是15到45分钟。
我是转的EGFP原始质粒，不是构建到pFastbac里的。是不是原始质粒的启动子不被识别？
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发表于 2014-3-10 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

45min will be better.
What is your original plasmid for EGFP and what is the promoter? Definitely you will need an insect cell specific promoter to promote its transcription. I don't think promoters from other organisms will work in insect cells. At this momment, I can see that your EGFP plasmid is not a good control for your transfection.
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发表于 2014-3-10 21:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的是EGFP-N1原始质粒，不是在真核细胞里都可以表达吗，在昆虫细胞难道不行？
请问转染后细胞基本上正常，可不可能是转染率低，导致少数细胞病变但被大量正常生长的细胞掩盖。可不可能通过继续养几代后细胞逐渐开始病变？
听说如果有病变的话72小时后就应该很明显，但我的就是看不出来，会不会是这个载体本身失去包装成病毒的能力了。应为我实在找不出来问题是出在哪里了。
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 小中大

pEGFP-N1 uses pCMV IE promoter which is mostly used in mammalian cells. Never heard any report to use that promoter in baculovirus expression. Some host transcription factors may not be there for efficient transcription.
Anyhow, that vector definitely is not a good positive control for your experiment.
As far as I know, titer of recombinant baculovirus won't go up from generation to generation. You observation MIGHT be due to low transfection efficiency.
It is true in most cases you will see morphology changes in 3 days and sometimes up to 5 days.
Suggestions
1. Re-prep your bacmid with special care for big DNA.
2. Do the pFastBac-beta gal recombinant bacmid as control.
3. Start a new vial of sf9 cells.
4. Why not lyse the cells and run SDS-PAGE and/or western blot to confirm your concern of experimental failure?
BTW, what is the protein you would like to overexpress?
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