蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】求Westernblot高手帮我分析这个条带

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】求Westernblot高手帮我分析这个条带

deducte[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 114515
精华 0
积分 142
帖子 44
信誉分 100
可用分 931
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
1

发表于 2014-3-11 20:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】求Westernblot高手帮我分析这个条带


左边一组的条带和右边一组的条带是上样同样的sample到同一张gel上，转到同一张membrane（用了15 well）的。而且一抗和二抗也都在同一个box里进行（中间粘胶带，但可通），发光后也在一张胶片上拍到的。上面的是NF-kB, 下面是actin，sample是nuclear的蛋白，但是把NF-kB除以actin后画出来的图却全然不同，，，，使我困惑，他们应该是一样的呀
或许有人说我上样时pipetting有问题，上的不均，但是我使用pipet有信心，不会出错。做western也不是一两天了，怎么会出现这种情况？！！！
而且这已经是第二次了。。。。
求各位高手和过路人不吝赐教！！先谢了！！


查看积分策略说明
附件
2014-3-11 20:41
27862633.snap.jpg (21.14 KB)
 
顶部
tangxin_80[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79896
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4621
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
2

发表于 2014-3-11 20:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.最大可能是你上样的问题，虽然你很自信。WB灵敏度高，同时也表明上样的毫微差异也将如同显微镜一样将其放大表现出来。
2.按我的理解你的膜是被你剪开了，在同一box孵育的。如果是这样，应该和整张膜孵育也有差异了。
3.底物的均一性问题。
4.显影操作，有时候我把底片加入显影液后底片会浮在显影液之上， 这可能也有影响吧。就是指显影时间长短的问题。定影时间也会有影。
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3

发表于 2014-3-11 20:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感觉最大的可能在上样上。
【1】蛋白煮沸5分钟后，最好用震荡混匀器混匀含上样缓冲液的蛋白。如果不混合，可能造成蛋白浓度不均。
【2】煮沸后，会有一些液体到小的离心管的管壁上，为了让离心管管壁上的液体流下来，有些人采用了离心的方法，注意离心的转速不要过大，否则也可能造成蛋白浓度不均匀的现象。
顶部
yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
4

发表于 2014-3-11 20:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，看上去你的NF-kB在一些样品中太多了，WB条带已经过饱和了定量就不可靠了。
顶部
deducte[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 114515
精华 0
积分 142
帖子 44
信誉分 100
可用分 931
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
5

发表于 2014-3-11 20:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位的建议！！
不过我上了10ug蛋白，已经是我用过的量中最少的了，我怕再少了actin出不来。怎么办？
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2014-3-11 20:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
WB曝光对结果的影响很大的，可以将actin和NF-kB分开曝光.
我觉得你的actin曝光时间和抗体稀释度是合适的，你的上样量，10ug确实已经很少了，不要再减少了。
对NF-kB，你可以将抗体稀释度减半，这样就不会出现过度曝光的问题。不过由于背景还好，你的抗体稀释度也是可以的，也可以考虑将曝光时间减半。这样做出来的结果会更可信。
此外，前面提到的上样可能也存在问题。我的一个做法是，在上样管里面加入上样缓冲液的时候，先用枪头搅一下，上样前要煮一下，然后，一定要离心，即使是这样，还是有可能出现没有混匀的现象。每一管取的时候，枪头都应该贴近液面。
呵呵。
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
7

发表于 2014-3-11 20:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上，您的结果怎么做得那么好？我的结果怎么总是非特异条带那么多，能指点一下吗？我蛋白上的是40ug每道，caspase-3抗体1:1000，4度孵育过夜。楼上战友说的，WB条带已经过饱和了定量就不可靠了，这里“WB条带已经过饱和”指得是什


查看积分策略说明
附件
2014-3-11 20:44
26790029.snap.jpg (14.04 KB)
 
顶部
gogo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77052
精华 0
积分 821
帖子 1341
信誉分 100
可用分 7487
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
8

发表于 2014-3-11 20:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主目的蛋白过爆了，就算2个条带上样量完全一样，一个条带跑得宽大一点，一个条带跑得细窄，过爆之后就会出现很大的误差，存在一个最佳曝光时间可以让它们的灰度刚好为1：1，具体是多少谁知道呢。
可以这样做吗？
把同一样品分别上20ug，40ug，通过调整曝光时间使其灰度刚好为1：2，此曝光时间设为最佳曝光时间。
actin也可以同样找到一个最佳曝光时间。
很有才哇
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
9

发表于 2014-3-11 20:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“把同一样品分别上20ug，40ug，通过调整曝光时间使其灰度刚好为1：2，此曝光时间设为最佳曝光时间。
actin也可以同样找到一个最佳曝光时间。”
确实很有才的一个想法，不过我想您真的好好做几次就会发现这样是行不通的。
呵呵！
顶部
ero11[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75131
精华 0
积分 684
帖子 1028
信誉分 100
可用分 5953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
10

发表于 2014-3-11 20:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问下楼主下面那个柱形图是用什么作出来的？
顶部
 12  1/2 12››