蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】目标就是不出！

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 15  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】目标就是不出！

shanzhapia696[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108884
精华 1
积分 297
帖子 229
信誉分 102
可用分 1839
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
1

发表于 2014-3-12 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】目标就是不出！

我做小鼠免疫器官的western blot，目标是MCP-1，分子量12kd。Actin跑出来了，也不错，可是目标一直不出。以下是我的条件，想让高手指点一下！
蛋白上样量100ug
分离胶是15%的，积层胶是5%的
电泳时电压90-120V，一般1.5h
转膜用的是NC膜，50V转50min
封闭1%BSA或5%脱脂奶粉室温1小时
杂一抗浓度1：200羊抗的室温4小时或4度过夜
杂二抗浓度1：500兔抗羊的室温2小时
一抗二抗洗膜时用TBST洗三次，每次10min，TBS洗一次，10min
可是就是不出，其中二抗浓度已经试过多个了，最后才用1：500，还是不出
请高手指教一下吧！我现在是连影子也看不见啊！！！很是郁闷！帮帮忙吧！
顶部
remenb[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75236
精华 0
积分 631
帖子 941
信誉分 100
可用分 5531
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2

发表于 2014-3-12 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1, 考虑有没有转过, 还是用丽春红染一下,看看小分子带如何.
2, 考虑下一抗本身的问题,来源,时间,稀释==
一家直言,仅供参考!
顶部
shanzhapia696[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108884
精华 1
积分 297
帖子 229
信誉分 102
可用分 1839
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
3

发表于 2014-3-12 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

跑之前我参考过园子里的各方建议，也注意过此问题，转膜用50V，30min的条件也没有出过！
顶部
shanzhapia696[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108884
精华 1
积分 297
帖子 229
信誉分 102
可用分 1839
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
4

发表于 2014-3-12 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗买的是中杉的进口分装，我没有染过膜！
顶部
shanzhapia696[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108884
精华 1
积分 297
帖子 229
信誉分 102
可用分 1839
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
5

发表于 2014-3-12 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白２１ＫＤ，９Ｖ半干转，转膜时间仅１５分钟，建议转完膜立春红染一下试试，或者考马染据说灵敏度更高，但是不可逆．
顶部
duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
6

发表于 2014-3-12 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有正对照重组MCP-1卖呢？或任何可用来作正对照的样品？
顶部
qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
7

发表于 2014-3-12 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

二抗时间是不是有点太长？
顶部
shanzhapia696[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108884
精华 1
积分 297
帖子 229
信誉分 102
可用分 1839
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
8

发表于 2014-3-12 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分子量是12KD，但是目标却出在26-34之间，而且很浅，只能用肉眼看见，凝胶成像照不了相！这正常么？
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
9

发表于 2014-3-12 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
【1】分离胶的浓度和最佳分离范围：
SDS-PAGE分离胶浓度 －－－ 最佳分离范围 （KD)
6%胶 －－－－ －－－－－－－－50-150
8%胶 －－－－ －－－－－－－－30-90
10%胶 －－－－－－－－－－－－20-80
12%胶 －－－－－－－－－－－－10－40
【2】建议你一步一步的来，先确定胶跑的好，如果确定了，再确定其他的。
【3】 看你膜上的情况。是不是蛋白转到膜上了。如果膜上的蛋白是好的，你再考虑后面的事，考虑曝光。如果膜上都没有，或者不理想，那就先把转膜搞定了。
【4】转膜一般是用衡流吧，用衡流好一些。
【5】目的蛋白的分子量比较小，建议用孔径小一点的膜，也不知道你的膜的孔径是多少？
【6】现在我感觉要先确定问题出在哪里。确定了问题在哪里，这样就可以集中经历，研究问题出在哪里了。这样分析问题，意义估计大一些。问题容易解决一些。
顶部
duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
10

发表于 2014-3-12 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 shanzhapia696 于 2014-3-12 16:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做小鼠免疫器官的western blot，目标是MCP-1，分子量12kd。Actin跑出来了，也不错，可是目标一直不出。以下是我的条件，想让高手指点一下！
蛋白上样量100ug
分离胶是15%的，积层胶是5%的
电泳时电压90-120V，一般1.5h
转膜用的是N ...

有没有同时做两板胶，然后一个转膜一个做考马斯亮蓝染色
先确定你电泳没有把小分子跑出去或者是蛋白含量够不够
还有，我加一抗后一般弄到37度去摇摇，就是摇菌的那个地方，貌似比室温要好
据说4度过夜更好，目前没有看出什么差别来
再试试看吧
顶部
 15  1/2 12››