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标题:【求助】WB膜的重复使用及显色

yonger[使用道具]
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发表于 2014-3-12 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB膜的重复使用及显色


最近要做western blotting磷酸化蛋白和未磷酸化蛋白，因为样本珍贵，想要跟大家交流一下同一张膜如何重复使用的问题。我也看了一些战友的帖子，多使用膜剥脱液，配方如下：
62.5mM Tris-Hcl,PH6.7
2%SDS
7ml巯基乙醇
总体积100ml.
各位使用过的战友感觉如何，原来的条带是否剥脱的干净？另外，大家是否有其它好的膜剥脱液的配方或是检测磷酸化蛋白、未磷酸化蛋白的经验，请战友不吝赐教！
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发表于 2014-3-12 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

62.5mM Tris-Hcl,PH6.7
2%SDS
7ml巯基乙醇－－－－－应该改成700ul
总体积100ml.
效果不错的。
放在65℃的水浴中45min，我用的是泡沫盒，这样45min后水温度还在50℃以上。
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发表于 2014-3-12 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在Western Blotting试验中，完成第一轮杂交后，经常需要重复使用同一张膜，进行第二次/第三次杂交，最为常见的情况包括：
（1）内参杂交。内参是在不同的组织细胞中普遍等量表达的蛋白，通过杂交内参，从而确实目的蛋白表达的增加或减少。
（2）信号传递研究中，检测其他目的蛋白。
（3）检测目的蛋白磷酸化（phosphorylation）或甲基化（methalation）后，继续检测总目的蛋白的表达。
利用同一张膜进行多次蛋白检测，不仅节省蛋白样品、省略蛋白电泳和膜转移等耗费性步骤，而且可消除重新上样带来的误差，使可比性更强。
进行新一轮杂交前，需首先去除第一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。传统的方法是使用具有强烈刺激性臭味的b-巯基乙醇， 55℃水浴振荡30分钟。
我用的是Wlaterson Western Stripping Solution ，不含b-巯基乙醇，只需室温条件下20～30分钟，即可去除前一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。同时不破坏膜上的蛋白抗原，不导致蛋白信号的减弱，可重复使用2～4次，且背景也很干净。
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发表于 2014-3-12 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢楼上战友的指点.另外,当目的蛋白与内参蛋白分子量相差较大,条带相距较远时,可否先分别加入一抗孵育,清洗后再加入二抗(如果二抗为同一种的话)后再显色呢,两者是否会产生干扰?是否有战友尝试过?
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发表于 2014-3-12 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目的蛋白与内参蛋白分子量相差较大,条带相距较远，你可以通过预染蛋白maker判断蛋白位置，剪2块小膜同时转膜，分别孵育
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ero11[使用道具]
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发表于 2014-3-12 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
当目的蛋白与内参蛋白分子量相差较大,条带相距较远时,可否先分别加入一抗孵育,清洗后再加入二抗(如果二抗为同一种的话)后再显色呢,两者是否会产生干扰?是否有战友尝试过?

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不建议如此做。一是因为担心目的蛋白可能有较深的backgroud或者non-specific binding band，会影响内参。二是内参蛋白一般情况下量较大，往往压片时只需要压几秒,而目的蛋白可能压片所需时间较长。三是将目的蛋白与内参的抗体放一起不可取。如先孵育一个抗体后，再孵育另一个抗体也会大大延长时间.
所以，同意楼上建议，可将membrane剪开后分别压不同的抗体。但是要先转膜，再将其剪开，然后不同的membrane孵育不同的抗体。
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发表于 2014-3-12 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

比如两个蛋白大小分别是80kD和90kD离得比较近，怕剪坏，你可以压完第一个抗体的片子，TBST洗一下，直接再封第二个抗体的一抗和二抗，再显影完全不受影响，最后扫完在photoshop上处理一下，完全分得开，如果一个是25kD一个是43kD,就可以第一次的时候从中间剪开，我不明白为什么要褪膜，首先怎么样能保证在整张膜的任何地方的褪膜的作用都是一样的，其次如果两个抗体都是43kD的蛋白，褪了一次再孵育一次，不能保证第一次就肯定影响不到第二次的结果，这种情况选一个别的内参做比较好。
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发表于 2014-3-12 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能告诉你的Wlaterson Western Stripping Solution 的配方吗？
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-3-12 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #8 redbutterfly 的帖子

我是买的试剂啊~~~~~~~~~~~~~
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发表于 2014-3-12 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果所测的蛋白分子量差距比较大的话，是不需要褪膜的，前一个蛋白显色后再直接孵育下一个蛋白好了。
褪膜的话，不管再怎么小心，抗原也会损失的
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