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标题:【求助】揪心的纵纹是DTT多了还是少了呢？

milkdog[使用道具]
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发表于 2014-3-12 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】揪心的纵纹是DTT多了还是少了呢？


很不好意思的说，我做2D十多次了，图谱还是不好，很明显的纵纹除不去，
搜索了很多以前的帖子，大多说是跟平衡有关，
比如平衡时间不够或是DTT的量的问题
我的平衡时间是每次12min
但关于DTT的量，我一直没弄明白，
到底是多了还是少了？？
程序上说是
平缓Ⅰ 胶条平缓缓冲液母液 10ml
DTT 0.2g
平缓Ⅱ 胶条平缓缓冲液母液 10ml
IAA 0.25g
但有很多人说IAA没将DTT平衡完导致纵纹，所以将DTT的用量减少甚至减半；
可也有专家说DTT不足导致蛋白出现垂直条带，而且我实验中试过 DTT/0.185g，IAA/0.30g结果那次的图谱纵纹很少，但第二次DTT/0.185g，IAA/0.32g揪心的纵纹又出现了，
这样分析是IAA的量多了，DTT少了的问题
现在看了好多帖子我不知道到底是DTT多了还是少了，到底该加多少？
把我的图贴上来请帮忙分析下，是不是有什么重要的步骤一直被我忽略了


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2014-3-12 17:02
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发表于 2014-3-12 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没做过2D， 但在1D里经常遇见这种情况，那就是跑得过了，跑出来多了就会出现这种回复性竖纹
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-3-12 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的时候每10ml缓冲液加100mg DTT,第二次平衡每10ml缓冲液加250mg碘乙酰胺，出来的图片挺好的。
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milkdog[使用道具]
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发表于 2014-3-12 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好的，谢谢，那就是说我DTT还是加多了
我试着加少点试试
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milkdog[使用道具]
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发表于 2014-3-12 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的DTT 0.0246g/8ml
IAA 0.148g/8ml
有点纵纹，但不明显
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-3-12 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

横纹才与DTT相关,纵纹和你的SDS-PAGE有关.
不过这个胶跑的真不敢恭维.
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milkdog[使用道具]
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发表于 2014-3-12 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呜呜，看到这样的胶我也很郁闷
那请问您觉得我的图这么多纵纹是什么原因呢？
我的SDS-PAGE凝胶是前一天晚上配的，用水液封，第二天上午平衡后跑的，12%的聚丙烯酰胺，胶应该没有问题吧
电泳缓冲液是0.1%SDS，25mM的Tris，192mM glycine
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发表于 2014-3-12 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的样品有问题，要纯化
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发表于 2014-3-12 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、图上没显示mark，不知道是否mark也有类似纵条纹,如果mark中没出现条纹，则说明问题存在于样品中，而不是二向电泳运行过程中
2、感觉样品有聚合现象，适当增加还原剂的量
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-3-12 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 平衡时间一般是15min吧，时间短了平衡不充分，时间长了蛋白损失。
2 DTT用量的问题，我也是犹豫了很久。后来发现大部分实验采用DTT 1％， IAA 2.5％的用量，我用的也挺好。
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