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标题:【求助】western blot 和 RT-PCR呈相反趋势怎么回事？

qqq111[使用道具]
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发表于 2014-3-13 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot 和 RT-PCR呈相反趋势怎么回事？


我做了一个基因的不同发育时期的western blot 和 RT-PCR，结果却呈相反趋势，怎么回事？要怎样去解释呢？？
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c86v[使用道具]
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发表于 2014-3-13 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. RT是指Real Time还是Reverse Transcription?
2. 两个实验都有严格的内参或对照吗？
3. 相反是指什么？蛋白随mRNA的增多而减少还是随mRNA的减少而增多？！
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qqq111[使用道具]
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发表于 2014-3-13 11:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RT是指Real Time,都有对照的.
结果是mRNA的表达在不同时期呈下降趋势，而蛋白质的表达却呈上升趋势，很纳闷，实验做的没问题！！
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-3-13 11:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，你的实验重复了几次？
如果单是一次的结果，并不能说明什么问题。
就WB而讲，存在的问题就有很多，首先上样前应该严格定量准确，为什么？因为在以后的内参曝光中，存在着一个平台期，并不能显示出上样是否真的一致，
给你一个图，这是我自己实验碰到的，同一张膜上的目的蛋白和内参，看样子是不是第二组表达下降了？但事实上，染了胶，第二泳道的上样量要小好多，因为蛋白浓度定量不准确导致上样量不一致，但是内参看着却是相当的。
同样，你能保证你的PCR结果么？实验中很多误差是不可避免的。
另外讲到，作了蛋白再做基因的问题，如果你的蛋白在体内是有好多异构体的，尤其是受体那一块，我算是吃了亏的，其实哪种异构体表达并不单和细胞组织的特异性有关，还和好多原因，比如细胞的状态，也许传一代和传几代完全不一样。比如你做了蛋白表达，刚好isoform 1表达， 而且表达增加的，然后你再养一批细胞， 作PCR，恰好占主导表达的就是另外一种isoform了，这样的问题不是不存在，要注意，所以引物什么的一定要设计好， 核酸蛋白marker一定要严格对照起来。
western blot 和 RT-PCR一般结果趋势还是相一致的，当然如果存在着其他调解的情况，如转录后，或翻译后水平的， 也不排除这种可能性。
对于你的情况，主要还是得多重复几次，一次的结果不一定就是正确的，
如果把你的问题再具体讲讲，战友们帮上的忙会多一些。


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发表于 2014-3-13 11:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

正如楼上所说，你可以把实验及结果在具体讲一讲，这样分析起来才会更有的放矢。另外我提到的严格的内参或对照，是指不管参照还有目的蛋白或mRNA都不能过饱和，正象iris_palm帖得图，下面的对照就是不合适的，要选择和目的蛋白或mRNA相似丰度的参照才能说明问题，或者如iris_palm所做的，用多种方法验证结果的可靠性。
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发表于 2014-3-13 11:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，首先感谢上面几位的回答，也感谢师弟帮我发这个帖子。下面我就把实验的具体细节说一说。
我做的是对一个基因的不同发育时期（不是细胞，是动物个体不同年龄阶段，正常发育）的表达情况的检测。先做的是RNA水平的，用Real－Time PCR检测的，以看家基因actin作为内参，得到的结果是，年龄增大，RNA水平是逐渐下降的，其中，在刚出生时水平最高。然后我想看看蛋白的表达情况，于是用了相同的个体采的样提取的蛋白做了一下WB，WB蛋白没有用看家基因，是用的总蛋白定量，用于跑2D的蛋白样，因为我是做猪的，没有猪的相应抗体，用的鼠的来代替（多抗），所以并不是很特异，（这是无赖之举）所有的样做出来杂带的亮度都差不多，只有在相应分子量大小的地方的带（基本可以确定是自己要的带）的亮度有差别。但是从初生开始，亮度是逐渐递增的，也就是说与RT检测的结果趋势是相反的。因为我是买的抗体，数量有限，而且还有很多样要做，所以没敢重复多次，但是整个做的过程我觉得应该是没有问题的，而且条带也很清晰，在同一张膜上做的。但是因为结果不好解释，就没再做，我想先找到可能的问题再做，这样对症下药，也不至于浪费东西。希望各位战友能够帮忙分析分析。
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发表于 2014-3-13 11:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上面说的isoform的问题或者是变异体（variant）的问题，应该是一个值得考虑的问题，我会好好的检查一下的，谢谢。
另外，我对蛋白质这一块做得不是很多，对于蛋白和RNA表达水平是否会出现不一样的趋势不是很清楚，我想知道的是这种情况是否存在？
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 小中大

我个人觉得您这个试验是否可以从两个方面来考虑这个结果？
一个方面是理论层次
另一个层次是试验结果分析
由于我自己水平的限制，说的可能不完整，甚至不一定对，不过既然是分析问题，我就当作抛个砖头，期待高手们的精彩分析。
理论层次：
1.mRNA与蛋白量的变化不一定呈线性一致性的关系，它与转录效率，转录后降解的速度也很有关系。
2.翻译水平上各种因素调节的关系，特别你是在做发育相关的试验，是否存在某种调控机制在发育的初始阶段，从翻译水平上抑制了这个蛋白的表达；发育中后期由于另外一些因子或者蛋白的表达，解除了该抑制因素的调控，蛋白表达逐渐回复？
3.一些研究热点，如miRNA，也是调节翻译水平的，导致蛋白不表达或降解mRNA。
4.....还有很多相关内容，你可以检索版子，大致的方向应该这样的，那可能其中涉及的因素是很多了，水平限制无法详细说明了，提供一个参考方向吧。
试验层次：
1.你目前所说的变化，都是基于你肉眼的观察，如wb结果？（不知道我是否理解正确？）
具体的RT结果和WB结果的统计学分析不知道你进行了没？你的样本量有多少，做了标准差、p值分析？是否有统计学意义？
2.你的mRNA与WB结果是否有统一的内参？如GADPH。如果没有统一的内参，你所称为的高低是不能够很具说服力的。
3.......
一些自己的看法，供你参考。水平限制，说的不对的地方，还请大家指教。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-3-13 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分析得很有条理，也给了我很多启发。
关于理论的1，我也想过，理论上应该有，但具体来说，一个蛋白的降解速率是多少，大概范围是多少？怎么知道它的降解速度或者是半衰期？有参考的网站吗？
关于理论的2，3我会考虑并查阅文献，谢谢。
关于试验层次的，wb是用的蛋白总量定的量，RT是做了real-Time,用看家基因actin矫正的结果，均为四个样本，蛋白，RNA的来源个体都一样。wb是肉眼观察的结果，RT是数据处理的结果。jnuxz分析得很对，可能内参不太一样，会影响结果的判断。但是因为我的结果中RT的两个阶段差别很大，是几百的差别，所以即使是误差，也不会这么离谱，而且RT我做过好几次，不同批次的样品也做过，RT应该是不会有错的，wb做过一个预试验，效果还是可以的
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whitesheep[使用道具]
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 小中大

wb是用的蛋白总量定的量 ？
你几个wb样品是在同一个标准曲线下定的量
还是不同批次定的量
希望你是所有样品一批定的量
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