小中大
这个是我自己做完酵母双杂交以后作的免疫沉淀
2.2 实验方法：
2.2.1 免疫共沉淀：
1) 冰上混合下列反应体系于1.5mlEP管
*10ul 体外转录的诱饵蛋白
*10ul 体外转录的文库蛋白
2) 用枪头轻混，室温放置1h
3) 加入10ul(1ug)c-Myc单抗或者HA表位多抗，勿将二者加入同一反应体系中
4) 用枪头轻混，室温放置1h
5) 同时准备A蛋白滴:
a) 轻柔涡旋几次以混匀蛋白滴
b) 取足够体积的蛋白滴加入1.5mlEP管，用量取决于Co-IP反应体系(3ulProtein A /Each Co-IP)
c) 以PBS洗涤两次，方法如下:
Ⅰ加入200ulPBS到EP管
Ⅱ7000rpm，30sec
Ⅲ以枪头去上清
Ⅳ重复上述过程
Ⅴ最后用PBS重悬蛋白滴至初容积(5b步骤时的体积)
6) 向反应管中加入3ul蛋白A滴
7) 适当混合,室温下旋转1h
8) 7000rpm，10sec离心
9) 小心去上清，忌搅动蛋白滴
10) 用washbuffer1洗蛋白滴5次，方法如下:
a) 加200ul洗液入EP管
b) 颠倒或拍打混匀(通常建议不使用涡旋,但有时,涡旋可减少蛋白非特异性结合到蛋白滴上)
c) 7000rpm，10sec离心
d) 弃上清
e) 重复上述步骤4次
11) 用洗液2洗蛋白滴2次，300ul/次，按10 a-d步骤洗
12) 用20ulSDS-PAGE上样缓冲液重悬蛋白滴
2.2.2 电泳
1) 80℃加热5min,以洗脱和变性样品
2) 将EP管置于冰上，短暂离心,取10ul上样到SDS-PAGE minigel(推荐使用0.75mm厚的minigel系统，对于大于25KDa的蛋白采用8%-12%的聚丙烯酰胺凝胶，小于25KDa的蛋白采用≥15％的聚丙烯酰胺凝胶)
3) 电泳分离（具体同上）
2.2.3 检测
1) 将SDS-PAGE胶在干胶仪中干胶（条件和步骤同上）
2) 干胶后在磷屏中曝光过夜
3) 将曝光后的磷屏放入Typhoon4003仪器中扫描检测
