蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】带GST标签的蛋白纯化不出来？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 13  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】带GST标签的蛋白纯化不出来？

kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
1

发表于 2014-3-13 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】带GST标签的蛋白纯化不出来？


RT。
图中上清里有融合蛋白表达，但在纯化时跟GST磁珠不结合，请高手指教。
蛋白分子量未100kd左右
自左向右为：Marker，未诱导，诱导，未诱导，诱导


查看积分策略说明
附件
2014-3-13 21:48
55351113.jpg (19.91 KB)
 
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
2

发表于 2014-3-13 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
原因可能比较多，你在图中也没有将相关的目的条带标出，不知道哪个是诱导沉淀，哪个是诱导上清，目的条带大约是多大最好把marker标出来？
如果在上清中有可溶性的蛋白存在，不与亲和胶结合一个是胶有问题（长时间失效），二个是蛋白有问题（结合位点被遮盖住），三个就是实验条件如缓冲液，pH有问题。
建议表达空载体后，破碎后的上清与亲和胶结合后再洗脱GST，验证下实验体系本身有没有问题，如果没有那就集中到本身蛋白的表达方面来，究竟是蛋白没有活性，还是说蛋白有活性但与亲和胶结合的位点被阻断了等。
顶部
079777chao[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107992
精华 0
积分 321
帖子 301
信誉分 100
可用分 2371
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
3

发表于 2014-3-13 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果仔细观察，和未诱导相比，你的诱导上清中不只一条蛋白过量表达，97kD上下，66kD下面，表达的蛋白降解了？翻译提前终止？或细菌蛋白也被诱导表达了？另外，正如你的诱导和未诱导实验一样，如果尽可能想清楚哪些实验对照要做或如何做，许多问题自己就可以完全分析出来了。
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
4

发表于 2014-3-13 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从表达的条带看，目的蛋白的表达量挺高，上样的应该不是破碎离心后的上清，而是全菌液吧。你应该设置三个样，即全菌液，破碎后上清，破碎后沉淀，加上loading buffer处理后上样，这样就能清晰的看出蛋白的表达方式。
从图上看还是怀疑你的蛋白以包含体的形式表达。
顶部
kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
5

发表于 2014-3-13 21:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yes4 于 2014-3-13 21:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
从表达的条带看，目的蛋白的表达量挺高，上样的应该不是破碎离心后的上清，而是全菌液吧。你应该设置三个样，即全菌液，破碎后上清，破碎后沉淀，加上loading buffer处理后上样，这样就能清晰的看出蛋白的表达方式。
从图上看还是怀 ...

上样都是裂解后离心完的上清
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
6

发表于 2014-3-13 21:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #5 kewanqi2011 的帖子

上样都是裂解后离心完的上清？
此上清非彼上清，看蛋白的表达方式，一般要将菌液超声破碎后离心，离心获取的上清和沉淀分别用loading buffer处理后上样，这样就能清晰的看出蛋白的表达方式。
你用的不是merck的bugbuster裂解液吧？我们都是超声破碎的，所获得的蛋白表达方式可以使用上面方法检测，如果使用上述裂解液可以询下他们的技术支持。
顶部
kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
7

发表于 2014-3-13 21:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上清沉淀都有，我只是照了上清的照片。纯化用的只是上清，这个不用在讨论了。不知道结合不上的原因是什么，因为我同时做的别的带GST标签的蛋白纯化的很好，所以操作肯定没问题。不知道有人有过成功的经验吗？
顶部
tudou85[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77498
精华 0
积分 394
帖子 468
信誉分 100
可用分 3171
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
8

发表于 2014-3-13 21:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

既然操作没问题，1）GST本身或稍小的降解产物可以纯化出来吗？2）做过western了吗？3）flow-through和上样中的目的蛋白等量吗？是不是可以结合但沉淀到磁珠上了？4）GST结构受目的蛋白影响从而不能结合。
顶部
kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
9

发表于 2014-3-13 21:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tudou85 于 2014-3-13 21:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

既然操作没问题，1）GST本身或稍小的降解产物可以纯化出来吗？2）做过western了吗？3）flow-through和上样中的目的蛋白等量吗？是不是可以结合但沉淀到磁珠上了？4）GST结构受目的蛋白影响从而不能结合。 ...

1）在GST蛋白的地方有一点带，26kd大小。2）WB 做了，没有带 3）上样是一样的。沉淀到磁珠？不知道是什么意思4）我也怀疑是这样的
顶部
tudou85[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77498
精华 0
积分 394
帖子 468
信誉分 100
可用分 3171
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
10

发表于 2014-3-13 21:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看来你是行家，我也许是班门弄斧了，说得不对的地方请见谅。WB做了没有带？anti-GST还是抗目的蛋白抗体？如果你有正对照的话，那你觉得贴图的蛋白带还是你要的东西吗？你纯化过程中各组分都跑胶了吗？穿流和裂解物对比有差异吗？还是我在其他回帖中提到的，实验只要设计严谨，正负对照合理，答案也就在实验结果中了。
顶部
 13  1/2 12››