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标题:【求助】涵体6M尿素溶解，电泳出现沉淀

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-3-15 09:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】涵体6M尿素溶解，电泳出现沉淀


我表达的蛋白质呈包涵体，我按照Novagen的操作手册超声细胞，然后离心收集包涵体，6M尿素溶解，离心取上清，我想检测下这个上清是否是我要的蛋白，上样的时候加了loading buffer后，就析出了一堆沉淀，煮了后也没有很大的用处！怎么会这样啊！大家检测这包涵体的溶解液的时候有没有遇到过这个问题是怎么解决的？或者是我什么地方出现了问题才导致了这个情况啊？
急等！谢谢
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guagua[使用道具]
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发表于 2014-3-15 09:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你离心后用上清液跑SDS－page看看有没有你要的蛋白
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发表于 2014-3-15 10:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵,正好我也在做包涵体的表达复性什么的.不过我也没有任何经验,只能从自己做过的方面来考虑了.
第一,你收集到破碎好的包涵体后,是否进行了包涵体洗涤?我们这里做的时候,都是先用TRITON洗一次,完了2M尿素洗两次,再1M尿素洗两次,最后离心后,才用6M的尿素溶解;
第二,你用多少克包涵体溶解到多少毫升的6M尿素中?如果你的包涵体量过多,可能就不溶了;
第三,我做的时候,是把包涵体溶解后,再进行复性,复性完了,把复性液离心,上清用三氯乙酸沉淀后再跑PAGE电泳,沉淀直接进行PAGE电泳,来看复性如何
不清楚你的包涵体是否需要进行复性,还是可以直接跑电泳.我自己也没有什么经验,是不是你的包涵体加得过多,直接就没有溶解在尿素中.你再说详细一些吧.
GOOD LUCK!!大家多交流多讨论,相互促进相互学习,共同进步
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发表于 2014-3-15 10:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我现在在准备做包涵体的纯化 ，我是按照分子克隆上面的做的
需要裂解 洗涤 溶解
有两个方法可供选择
而且它的尿素需要8M尿素溶解
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发表于 2014-3-15 10:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在换了盐酸胍来溶解新收集的包涵体，结果我发现哪怕是只用2M的盐酸胍溶液不含蛋白质和上样buffer混合都有无数沉淀析出来了，估计是SDS沉淀吧，我也只是这样怀疑，我刚刚又在上样，结果发现了这样的事实，搞得我很郁闷！这都凌晨了，疯了！
答楼上的楼上，我是完全按照Novagen的操作手册来的，收集菌体，超声破碎，离心收集包涵体，用不含盐酸胍的binding buffer洗涤，然后用6M的盐酸胍溶解，离心取上清，0.45um膜过滤，然后我就想检测下，我要的目的蛋白还在否，结果就发现盐酸胍和上样buffer生成沉淀了！哀号！
PS：你的头像太彪悍了！我缺睡得本来就～心，现在更了：（
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发表于 2014-3-15 10:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用盐酸胍溶解液直接加loading buffer跑电泳肯定是不行的，即使没有沉淀也因为盐浓度太高，跑不出好的条带。用尿素溶解好像没遇到你的情况，我想即使有点沉淀，你离心一下去上清跑也是可以的。
另外，你为什么非要溶解以后在跑呢，你直接取点包涵体，加1×loading buffer 溶解上样就可以了，就象菌种表达检测一样。
如果你用尿素或盐酸胍能把包涵体几乎全部溶解，那你要的蛋白肯定在溶解液里了，你说是不是?
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发表于 2014-3-15 10:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在做包含体,是GST融合蛋白,在裂解buffer 中加了TRITON X-100,超声破碎后,沉淀用Triton和DOC 洗两次,6M的尿素洗两次,然后用8M的尿素溶解,溶解效果不好,沉淀中有很多目的蛋白,而且上清中有很多杂蛋白.请大狭指点,谢谢
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guagua[使用道具]
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发表于 2014-3-15 10:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我有一段小分子量的蛋白，诱导表达后以包涵体形式存在，
请问，我怎么设计我的纯化步骤？
望赐教!
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