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晕！170KDa属于大蛋白，条件需要多摸索，建议延长转膜时间，3-5hr都可以考虑的；更关键的是，这种较大的蛋白，一般胶浓度6%都可以考虑了，但是如果你要用actin做内参，那么只好用最高7.5%的胶，因为胶浓度越高大蛋白越难转，当然啦，像老手这条倒不是特别的固守。转膜时候有条件就低温，时间长发热厉害。
其次你抗体用的比例so strange！常规1抗是1λ（你用的是0.2λ）；2抗是1：5000，你的稀释比例倒置了！当然如果你要说是upstate推荐的话，可以试试瞧。因为我觉得你的基础太弱，Actin显成这种水平，无法判断upstate的推荐对你而言是否合理！但是2抗还是先降下来，国产的2抗我用过1：5000也是可以的，只是可能使用的次数（寿命）短于进口的。
另外说明一下：不知道你怎么养成的习惯，为什么要用立春红染色，既然有了预染的Marker，肉眼可见转膜效果，那么你不觉得再用立春红多此一举嘛？因为你用了立春红，哪么你就需要漂洗先，这对你目前转膜的情况是又一步的损失。同样封闭时间可缩短0.5hr足够长了，有时候偷懒5min就上一抗；因为你把膜摇摇换换越久，像你目前的技术，我担心等你上抗体的时候什么都没了。一抗二抗的不用改。
此外，其它的考马斯亮蓝染色的结果对试验的问题说明无任何增益，它不能说明任何问题（当然说明你很细致，仔细找过问题了）。只需要看你转膜后，预染Marker和Actin的结果。
最终建议：170KDa对你来说，有点困难，希望你能就近寻找专业人士提供帮助，因为看来你的问题还很复杂。你现在最紧要的是多跑跑8%测测Actin练手，这个抗体我们采用的是sigma的Mab 0.1λ甚至0.03λ都能在5sec显出极强的荧光。这是我们实验室的入门功课。因为就你的试验条件和Marker的深浅我认为Actin至少能很强，但事与愿违，也就是你不仅转膜过程有待提高（专指EGFR，Actin因为太abundant而且大小合适随便转随便有），整个试验操作的流程和采用体系都需要完善，这不是一句话能说明的问题。
PS：膜和滤纸泡不泡无所谓，彻底湿了就行啦。做这么久了，哪有时间等它泡膜，搞不好耽搁一下，一天的试验任务就完不成了
