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标题:【求助】做过gst纯化的进

dhpbj[使用道具]
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发表于 2014-3-16 22:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做过gst纯化的进


洗拖下来的1、2、3
不知原因？表达问题？纯化问题？


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2014-3-16 22:41
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-3-16 22:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不明白楼主的意思
GST纯化，一步直接用10mM的谷胱甘肽就可以洗脱下来了啊。怎么来了一个洗脱一、二三、呢
至于蛋白是不是表达，直接用诱导前后的跑胶比较就可以看出来了。
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skytree[使用道具]
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发表于 2014-3-16 22:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的洗脱1.2.3是不是你梯度洗脱收集的不同管的样品啊，图上看不出有目的蛋白被洗脱的迹象，有几种可能
1.没有表达，就象楼上说的设置诱导表达对照，分别电泳就能看出有没有表达。
2.如果表达了可能是没有挂上，应该同时收集穿过液就行对比电泳，就可以看出来。
3.也有可能你的蛋白表达了，但是是截短表达，标签丢失了也有可能。
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dhpbj[使用道具]
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发表于 2014-3-16 22:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位版大的关心，
洗拖1、2、3就是说明书上的colletion1;colletion2;colletion3;
洗拖1是破碎上清过的柱（结合）
洗拖2是用wash buffer洗拖柱；（除去未结合蛋白）
洗拖3是谷胱甘肽洗拖下来的GST蛋白；
3楼可能是没有做过GST纯化，本人以为各位园友都知道的，所以没有解释清楚，见谅！
洗拖2是用10倍体积柱材洗拖下来的
洗拖3是用3倍体积柱材洗拖下来的
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lorri[使用道具]
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发表于 2014-3-16 22:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

虽然我们都没有做过GST纯化，但是有一点确定的是你的蛋白没有提出来……另外你应该加个对照……估计蛋白没有表达，或者是在包涵体里面。
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-3-16 22:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果完全按照说明书上进行，纯化应该没有问题，建议多发酵一批重复。
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dhpbj[使用道具]
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发表于 2014-3-16 23:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lorri 于 2014-3-16 22:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

虽然我们都没有做过GST纯化，但是有一点确定的是你的蛋白没有提出来……另外你应该加个对照……估计蛋白没有表达，或者是在包涵体里面。

因为是破碎后，沉淀没有条带；所以判断是上清。又根据上清表达量少的特点，所以我有些怀疑最后洗拖的体积太大。
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发表于 2014-3-16 23:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dhpbj 于 2014-3-16 22:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢各位版大的关心，
洗拖1、2、3就是说明书上的colletion1;colletion2;colletion3;
洗拖1是破碎上清过的柱（结合）
洗拖2是用wash buffer洗拖柱；（除去未结合蛋白）
洗拖3是谷胱甘肽洗拖下来的GST蛋白；
3楼可能是没有做过GST ...

恰恰是我还做过一些纯化，也包括GST亲和层析。
纯化中洗脱应该专指洗目的蛋白的步骤。电泳检测应该包括原液、流穿、冲洗、洗脱，不同的纯化方法，洗脱有可能有多个组分，比如离子交换可能有不同盐浓度的洗脱组分，而GST通常就一个洗脱组分。所以是你用词不当，造成大家的误解。
楼主看来还需先解决目的蛋白是否已经得到表达的问题，光凭借沉淀没有目的蛋白就断定在上清是不是太武断了些。
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-3-16 23:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从电泳图（给你用photoshop处理了一下）上看有蛋白带的存在（椭圆部分），不知道是不是你的目的蛋白。如果是那你的蛋白表达量太少了吧。


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耗子===[使用道具]
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发表于 2014-3-16 23:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 bluelake 于 2014-3-16 23:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

从电泳图（给你用photoshop处理了一下）上看有蛋白带的存在（椭圆部分），不知道是不是你的目的蛋白。如果是那你的蛋白表达量太少了吧。

这样的话，建议楼主将洗脱三浓缩之后跑胶。然后加一个蛋白marker，以及诱导前后的取样，跑胶就更加清楚了。
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