蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】有谁用过Amersham公司的AKTA purifier10

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 21  1/3 123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】有谁用过Amersham公司的AKTA purifier10

youyou99[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75216
精华 0
积分 583
帖子 765
信誉分 100
可用分 4756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
1

发表于 2014-3-17 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】有谁用过Amersham公司的AKTA purifier10


大家好，我做蛋白纯化，由于刚进的Amersham公司的AKTA purifier，使用中遇到好多问题，还请大家帮忙
1.使用预装柱HiTrap-DEAE-ff 1 ml时，老是达到报警压（0.3MPa），使用的样品为BSA（已用0.45um的滤膜过滤）,即使将流速降到0.2ml/min也出现这种情况，将柱子清洗后再试时用清水正常，而换用缓冲液后又出现上述情况。是我的样品浓度太大还是不适合用该柱子进行演示实验？
2. 上样之前使用同一缓冲液有时跑出的曲线呈现锯齿状，是什么原因？
3. 在方法编辑中如何设定empty-loop-with的数值，比如我上0.5ml的样，这个数值该如何设定
4. 样品收集的命令设定中，如何在F1和F2之间自动转换？是不是如果没有人进行全程监控，机器无法实现两个positions间的自动转换？当我把position转到F2，设定按峰收集，当没有峰出现时，是不是需要由人把收集盘上的臂转到一侧？
5.当一直使用清水或同种缓冲液时，电导率（Cond%）和浓度为什么会随程序的进行而呈现上升趋势（并未上样），仅仅是因为程序设定了而按程序执行吗？会不会与实际操作时不一致？
在操作中所用缓冲液均已用0.45um的滤膜过滤
顶部
babybabe[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72893
精华 1
积分 275
帖子 226
信誉分 102
可用分 1936
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
2

发表于 2014-3-17 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

ATKA purifier编程功能不是很强，我通常采用手工调换的方式进行条件摸索
1 正常条件下是不会出现这个问题，你检查一下整个管路，看哪里压力出现增大现象，怀疑是某个地方出现脏东西了。另外你的缓冲液是什么缓冲液，BSA一般溶解度很高，不会出现蛋白沉淀的现象
2 你能否调节OD280显示的区间，一般每次测量稍有误差，正负不过0.0几，如果OD280显示区间很小，出现锯齿状是正常的，如果显示区间比较大，如10OD，出现锯齿状就说明测量的不准确了，需要Amersham工程师来校准
3 我很少用自动编辑，这块不熟悉
5 这是基线平移，应该是仪器的问题产生的，在保修期内，赶紧叫工程师吧
顶部
youyou99[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75216
精华 0
积分 583
帖子 765
信誉分 100
可用分 4756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3

发表于 2014-3-17 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们是刚开始用这个仪器，应该不会出现脏东西吧？最初流动很好，只是我上样后出现报警现象，第二次再用即使不上样也出现了报警，可是样品已过滤了，我用的0.05M的Tris-Hcl。
我现在也是用手动，如果loop环是0.5ml的，那上样只要多于0.5ml就可以了吗？上次工程师说加样量有个注意事项，可我忘了，那个工程师也联系不上
样品收集时你是怎
顶部
ladyhuahua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76658
精华 0
积分 984
帖子 1667
信誉分 100
可用分 9116
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-8
状态 离线
4

发表于 2014-3-17 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
AKTA，一般用0。22um的膜过滤
顶部
ROSE李[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76171
精华 0
积分 466
帖子 611
信誉分 100
可用分 3866
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
5

发表于 2014-3-17 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好，我做蛋白纯化，由于刚进的Amersham公司的AKTA purifier，使用中遇到好多问题，还请大家帮忙
1.使用预装柱HiTrap-DEAE-ff 1 ml时，老是达到报警压（0.3MPa），使用的样品为BSA（已用0.45um的滤膜过滤）,即使将流速降到0.2ml/min也出现这种情况，将柱子清洗后再试时用清水正常，而换用缓冲液后又出现上述情况。是我的样品浓度太大还是不适合用该柱子进行演示实验？
看看是不是柱前的在线滤膜（On-line filter kit）是否脏了，因为其在柱前相当于一个0.22um的膜的作用，如果样品太脏了，它就脏了会引起系统的压力升高，你可以把滤膜拿下来，用0.2MNaOH浸泡20分钟或者用超声超20分钟，然后装上应该就没有问题。
如果还不行，可以先不装柱子，空系统用1 ml/min水跑一下，记录压力，然后换成平衡缓冲液用1 ml/min跑一下，记录系统压力，更换缓冲液时记得用更换的液体清洗一下泵。如果空跑的系统的压力本身就很大，建议在manual中，system中进行一下泵的calibration,校正一下
2. 上样之前使用同一缓冲液有时跑出的曲线呈现锯齿状，是什么原因？
请问缓冲液是否脱气，如果不是riboenzyme 说的情况，有可能是气泡引起的鬼峰，建议将缓冲液脱气后适用
3. 在方法编辑中如何设定empty-loop-with的数值，比如我上0.5ml的样，这个数值该如何设定
如果你的loop是多大体积的，建议就写多大体积，例如你使用的1ml的loop,就写1，这样你的上样体积就是1ml
4. 样品收集的命令设定中，如何在F1和F2之间自动转换？是不是如果没有人进行全程监控，机器无法实现两个positions间的自动转换？当我把position转到F2，设定按峰收集，当没有峰出现时，是不是需要由人把收集盘上的臂转到一侧？
不需要人转动，如果你设定的是F2，那么当没有峰出现时，洗脱出来的液体自动waste，不收集，你设定的F2只是说当你出峰的时候，出峰的液体从F2中流出收集
5.当一直使用清水或同种缓冲液时，电导率（Cond%）和浓度为什么会随程序的进行而呈现上升趋势（并未上样），仅仅是因为程序设定了而按程序执行吗？会不会与实际操作时不一致？
是否是因为你的柱子没有平衡好，才会出现该情况，你可以先不将柱子接在系统上，单独使用水或者缓冲液清洗，如果没有出现这种情况，那就是柱子的问题，如果出现了，那就是系统UV和cond的毛病，可以联系工程师进行解决
在操作中所用缓冲液均已用0.45um的滤膜过滤
......
顶部
ROSE李[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76171
精华 0
积分 466
帖子 611
信誉分 100
可用分 3866
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2014-3-17 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们是刚开始用这个仪器，应该不会出现脏东西吧？最初流动很好，只是我上样后出现报警现象，第二次再用即使不上样也出现了报警，可是样品已过滤了，我用的0.05M的Tris-Hcl。——应该是在线滤膜堵了
我现在也是用手动，如果loop环是0.5ml的，那上样只要多于0.5ml就可以了吗？上次工程师说加样量有个注意事项，可我忘了，那个工程师也联系不上
两种方法可以用于装上样环；部分或完全装满。
装料类型 装载体积
部分装满 最大上样环体积的 50%
完全装满 上样环体积的 2-5 倍
部分装满 (Partial filling) 当需要高回收率时，使用部分装满。装载的样品体积应最多为上样环体积的50%。体积的精确度是指注射器的精确度。部分装满使注入体积可以变化，而不改变上样环，不浪费样品。在样品装载前，上样环应用缓冲液完全装满。部分装满如下进行：
注：液流必须关闭, 例如，当手动运行系统时，按暂停。
1 将上样阀置于 LOAD 位置。
2 用大体积（五倍于环体积）缓冲液装载注射器。
3 用缓冲液仔细装满上样环。
4 将上样阀置于 INJECT 位置。
注：如果在上样阀位于LOAD 时将注射器取出，将发生自排放，空气将进入上样
环。
5 将所需体积的样品装入注射器。
注：约不到上样环体积的一半（50%）装载进环。
6 将注射器插进上样阀上的注入装料接口。将上样阀置于 LOAD 位置。
注：在阀位于LOAD 位置之前不要装样品。
7 轻轻地将注射器内容物装进上样环。
8 将注射器留在原处。当阀转换到此方法的 INJECT 时样品将注入柱。
注：如果在样品注入柱之前插入注射器，将发生自排放，上样环将排空。
完全装满 (Complete filling)
在此方法中，使用过量样品以确保上样环完全装满，从而得到可重复的样品体积。在准 备加样中， 样品体积应至少两倍于上样环的体积。
为得到分析的再现性，应使用5倍于上样环的样品体积。为达到最大上样环体积的95%，需要的样品体积约2~3倍于上样环体积。五倍环体积可确保更好的精度。用环完全装满，样品体积仅能通过改变环的大小而改变样品体积。
如下所述完成完全装满：
1 将上样阀置于 LOAD 位置。
2 用样品（2-5 倍环体积）装入注射器。
3 轻轻地将注射器的内容物装进上样环。
4 将注射器留在原处。当阀转换到方法中的 INJECT 时，样品被注入柱。
注：如果在样品注入柱之前插入注射器，将发生自排放，上样环将排空。
样品收集时你是怎么操作的，按峰收集和按组分收集之间的转换即使设置了也要再手动转换吗
样品按峰收集和按组分收集之间的转换，只要你设置好了，系统会自动控制不需要手动转换。不过一般是这样的，按照组分收集是比较大量的样品收集，也是在你摸索好条件之后知道这个组分是你所想要得才进行组分收集，而按照按峰收集我们会使用峰收集和体积收集相结合，也就是没出峰的时候按照固定体积来收集，出峰的时候按照另一个体积来收集，当然你要告诉系统什么是峰
如果联系不上工程师，可以打800-810-9118询问
谢谢啦
......
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
7

发表于 2014-3-17 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我上次好像没听到Amersham有说部分装满和完全装满.....
但是样品加入上样环时有个要求,就是加入上样环的样品量要比你所使用的上样环多0.5-1ml,以保证上样环内不会有气泡...
至于楼上说的部分装满,其实好像不用这么麻烦的,在用wizard设定程序时,在设定上样量选manual,然后输入你要的上样量,最大不超过你的上样环容量就可以了.像2ml的上样环,完全可以一次只上0.5ml,剩下的可以在后面重复程序时继续使用
顶部
youyou99[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75216
精华 0
积分 583
帖子 765
信誉分 100
可用分 4756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
8

发表于 2014-3-17 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢两位的解答，真的很感谢！！
再问一下，反压阀在哪个位置？起什么作用啊，上次问的那个问题
“当一直使用清水或同种缓冲液时，电导率（Cond%）和浓度为什么会随程序的进行而呈现上升趋势（并未上样），仅仅是因为程序设定了而按程序执行吗？会不会与实际操作时不一致？”
我使用的是梯度洗脱的程序，不过未上样时也会出现梯度，电导率（Cond%）和浓度也按设定的程序执行，请问是否正常，仅仅因为按程序执行吗？
另外AKTA层析仪可以用国产的玻璃柱子吗，哪个公司的比较适合？离子交换，疏水，分子筛用的玻璃柱都有什么型号的，谢谢啦
顶部
ROSE李[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76171
精华 0
积分 466
帖子 611
信誉分 100
可用分 3866
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
9

发表于 2014-3-17 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢两位的解答，真的很感谢！！
再问一下，反压阀在哪个位置？起什么作用啊，上次问的那个问题
你说的反压阀是指的Flow restrictor, 限流器吗？当缓冲液受压从层析柱里和监察器流池流出来的时候，压力会突然间释放，原本溶解在液体内的气体便有可能会以气泡形式冒出，影响液流和监察器的检测，影响实验结果。这种情况在高压反相对尤其严重，因此便需要用限流器来保持整个系统的压力，避免气泡形成。一般是安放于组份收集器之前。监察器流池之后。ÄKTA系统使用的限流器有两种：FR-904 产生 0.4Mpa 的压力，在一般情况下使用。FR-902 产生0.2Mpa的压力。如要使用pH电极检测或低压填l料（如Sepharose Fast Flow, Sepharose High Pertormane，压力上限0.3Mpa）时使用。另外，在使用较传统的“软凝胶”，流速很低时（<0.5 ml/min）。由于几乎完全没有反压，有时出现流速不稳现象。可以将限流器FR-902,加在泵与层析柱之间，FR902会产生0.2Mpa的压力，使ÄKTA系统的泵保持准确稳定的流速。可以放心，所有柱前的反压不会影响到层析柱。
“当一直使用清水或同种缓冲液时，电导率（Cond%）和浓度为什么会随程序的进行而呈现上升趋势（并未上样），仅仅是因为程序设定了而按程序执行吗？会不会与实际操作时不一致？”
浓度上升你是指的conc吗？那肯定是你程序中设定了线性洗脱吧，那当然随着你设定的程序执行了
我使用的是梯度洗脱的程序，不过未上样时也会出现梯度，电导率（Cond%）和浓度也按设定的程序执行，请问是否正常，仅仅因为按程序执行吗？未上样出现梯度？你是这么设定程序的吗？建议你最好在run之前读懂你自己编辑的程序，然后才能比较好地分析结果
另外AKTA层析仪可以用国产的玻璃柱子吗，哪个公司的比较适合？离子交换，疏水，分子筛用的玻璃柱都有什么型号的，谢谢啦
可是使用国产的玻璃柱子，但是必须注意所配的国产柱子的管路，接头，耐受的压力是否符合你的要求，能否安装在系统上，还有就是国产柱子的筛网孔径是否合适，万一不合适你的凝胶泄漏了，就损失比较大了，国产产家很多，例如沪西
顶部
youyou99[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75216
精华 0
积分 583
帖子 765
信誉分 100
可用分 4756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
10

发表于 2014-3-17 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我按照你说的校正方法进行了压力调零，压力起初恢复了正常，可是后来又出现报警，谢谢！
再问一个关于装填料的问题，与AKTA配套的DEAE-Sepharose FF填料要自己装柱，可我不知道最大压力和default flowrate该如何设置，填料使用说明书中只是说流速为300-600cm/h(15cm bed height, 直径？？1bar, xk 50/30colum)，我的柱子是上海华美的，bed height 15cm，直径1cm，那两个参数该如何设置（cm/h 和ml/min的关系？），流速和柱床高度之间，最大流速和默认流速间有什么关系？
呵呵，刚使用新的仪器问题比较多，还请多多指教
顶部
 21  1/3 123››