【求助】关于免疫共沉淀

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标题:【求助】关于免疫共沉淀

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教各位，免疫共沉淀中，一定需要通过表达蛋白吗？能否用组织匀浆呢？我看了好多资料都是通过真核表达，转染细胞，收集蛋白。另外，在沉淀的时候都用的是单抗，能否用多抗呢？真核表达的蛋白量一般都不高，有点郁闷。请指教！谢谢

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

免疫共沉淀的精髓在于相互作用的蛋白都要保持天然结构和活性，这样他们才可以结合合并沉淀下来，如果要研究的蛋白都来自于原核生物，细菌表达应该不会有问题，另外体外表达也可以用啊。

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果用大肠杆菌表达，表达出来的蛋白没有活性，应该不能用于免疫共沉淀吧。如果从组织匀浆，操作小心，环境达到要求，不知道能否使得获得的蛋白保持活性。

zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

组织蛋白提取合适绝对可以IP无疑，国外文献中有很多例子
具体的条件我也在摸索中，看看有没高手来指点

taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

组织抽提蛋白也不是都能用于IP,我们使用的各种抽提试剂很多都是有相当去污剂成分存在的，而且针对一些特殊的蛋白如跨膜蛋白，普通的抽提试剂是满足不了要求的。当然常见的组织抽提蛋白是可以直接使用IP的。

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家的帮忙哈。那么抗体呢？有没有什么要求呢？

bring[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

抗体有一定要求的，如果是买的话，请一定要看清说明书上有没有写可用于IP，如果是自制的话，则只能试试看了。首先要明确的是是否可以把自身给沉淀下来。组织匀浆的话，可以用用温和的裂解液稀释。

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以买抗标签的抗体来沉淀吧。自己制备的抗体在纯度和量上都不太好。

fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

当然可以用“抗标签的抗体来沉淀”，很多文章验证蛋白相互作用都是体外表达带不同标签的两个蛋白，分别用抗标签的抗体IP，再用另一个抗标签抗体作western验证相互作用。