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标题:【求助】不同的抗体能否同时孵育

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】不同的抗体能否同时孵育


向各位战友请教一下，我现在做WB ,内参是GAPDH,40KDa，目的蛋白是200KDa左右的，各自的一抗和二抗均不同，试问能否可以一起孵育，会不会有交叉反应而影响结果？还有就是我目的蛋白最后曝光结果：有非特异性条带，色深，而目的条带色很浅，请教各位问题主要处在哪?一抗是多抗，是不是因为抗体特异性差？谢谢各位帮忙！
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-3-17 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不要一起孵育，可以用剥离Buffer处理后再加另外一种抗体，在同一张膜上显色，配方园子里有；
多抗是有可能有多条带的，和它是多克隆抗体有关，特异性差，会有交叉反应。
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发表于 2014-3-17 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以根据marker，直接将膜剪开，分别上不同的抗体，事半功倍，还省去了strip的步骤，而且内参结果肯定比strip要好。你不妨试试。我一直都是这么做的。
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-3-17 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位！
我又做了一次 ，结果还是非特异性条带深，大概在60KDa处，而目的蛋白很淡，几乎没有；内参估计估计是给转过了，这次转了1h 10min。
重新裂解蛋白单纯做了电泳，考马斯亮兰染色后发现：200KDa处蛋白条带本身就特别淡，是不是我细胞裂解又问题啊？我目的蛋白是多聚体，是否因为裂解过强而使多聚体降解了？实验涉及的是软骨细胞，目的蛋白是蛋白多糖，裂解液是成品RIPA.
请各位再帮帮忙，有做相关方面的请多多指教。多谢了。
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glass[使用道具]
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发表于 2014-3-17 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该可以，我师姐有将actin和目的蛋白条带一起孵，有出来结果。
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glass[使用道具]
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发表于 2014-3-17 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位！
我又做了一次 ，结果还是非特异性条带深，大概在60KDa处，而目的蛋白很淡，几乎没有；内参估计估计是给转过了，这次转了1h 10min。
重新裂解蛋白单纯做了电泳，考马斯亮兰染色后发现：200KDa处蛋白条带本身就特别淡，是不是我细胞裂解又问题啊？我目的蛋白是多聚体，是否因为裂解过强而使多聚体降解了？实验涉及的是软骨细胞，目的蛋白是蛋白多糖，裂解液是成品RIPA.
请各位再帮帮忙，有做相关方面的请多多指教。多谢了。
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蛋白提取怎么样肯定可以摸索条件和跑胶看到结果的，至于你想一起孵育目的蛋白和内参，我觉得在一张膜上肯定是不可取的，鉴于你的两个蛋白分子量相差太大，一起转膜在剪开膜做不同抗体孵育也不是好办法，因为蛋白相差太大，无法兼顾两个蛋白都转移充分，他们时间肯定是相差两倍以上，而且在同一浓度的PAGE胶上也不可能都能很好的分开，而你又不愿跑两块胶，所以，为了节约样品，同时保证内参的绝对真实性，我觉得你最好用梯度胶，这样才能分开小分子量的内参，也能分开大分子量的目的蛋白，梯度胶可以买也可以自己配，建议最下面倒12.6%的上面倒7.5%，再加上5%的积层胶，跑完以后依据预染MAKER位置将胶划开分别转膜，时间以各自的分子量设定，以后就常规做法了
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-3-17 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢前辈指点，我决定将内参和目的蛋白分开跑胶和转膜。我们目前用半干转系统，是不是半干转对大分子的转膜效果不太好，有人建议用湿转，但本实验室湿转坏了，很无奈。
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glass[使用道具]
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发表于 2014-3-17 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分离大分子蛋白的确湿转比半干转效果好，但我们隔壁实验室用半干转200KD的蛋白效果还是可以，所以你就最好用预染MARKER调整好转膜条件，预祝实验顺利！
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发表于 2014-3-17 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还是想办法用湿转吧，分子量太大了，干转效果不好，尤其是这个蛋白丰度不是太高的时候。
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-3-17 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位！
请问 ，他们用的是百分之几的分离胶？我用5％的跑，结果发现Marker大分子量的几乎看不到了。今天用湿转试了一次转膜效果还不错，WB也有条带了，但因Marker看不清，所以无法确定条带是否是我们的目的蛋白。
WB做了快两个月了，还是没出结果，都快没耐心了，准备缓一缓过完年再继续，但愿能有点进展。
再次感谢各位热心的战友。
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