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T7原核表达系统，需要在设计时注意的是：1、阅读框的问题；2、稀有密码子的问题。这两个因素都会造成表达的失败。至于其他讨论很热的问题，IPTG，温度，时间等等，都是在表达水平和表达状态上的调整，而在构建表达载体时，应关注上述两点。
阅读框问题大家都非常清楚，至于稀有密码子，很多人做之前都不去考虑。稀有密码子是指的大肠杆菌中相应tRNA非常稀少的8个密码子，可以用软件（如：cuturl('http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/')）分析你的目的基因，就可以知道所含稀有密码子的丰度和位置。这里不是说只要含有稀有密码子就不表达，如果你的基因稀有密码子丰度小，位置不连续，对表达的影响一般不大，但如果是连续多个的稀有密码子，可能会造成翻译的提前终止，就会对表达产生影响了，如果这个连续的稀有密码子串在ORF的尾端，你有可能看到表达出来的带比预期要小（有时可能表达出两条带，一条完整的，一条提前终止的），如果是稀有密码子串出现在前端或中部，则有可能因为表达条带比预期差太远而被我们忽视，或者干脆就跑出分离胶了。
因此表达之前要先对目的基因进行分析，如果有连续的稀有密码子，可通过两种途径解决：1、点突变改造基因；2使用改造的表达菌（例如BL21 codon plus RIPL等，一般是带氯霉素抗性，转化、培养和表达时注意加入表达载体的抗性时，要同时加入氯霉素，否则会造成菌株表达稀有密码子tRNA的质粒丢失）。
至于你说的BL21质粒拷贝低，不知道是不是通过提质粒的产量得出的结论，BL21质粒的产量低是由于菌的特性造成的，而且BL21菌的核酸酶没有敲出，质粒的完整性是不如DH5α和TOP10等菌株的；而且表达时，并不是拷贝数越多越好的。
