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标题:【求助】BL21 和 Rosetta 表达的疑惑

xevin[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】BL21 和 Rosetta 表达的疑惑

表达一个哺乳动物病毒的N蛋白
克隆到载体上后
开始用BL21表达
虽然量不是很大 但还可以接受
－80保存了两三个月
再拿出来划线 挑菌 诱导 同样的条件居然不表达了
于是重新用质粒转化了Rosetta
挑单克隆过夜生长还正常
但第二天1：100转接（Amp Chl） 扩大培养就长不起了
10个小时之后浓度还是很低
请大家帮忙分析
一 为什么同样的条件BL21开始能表达 后来表达不成功
二 Rosetta过夜菌转接的时候能否扩大浓度比如1：10这样？扩大浓度后是否有利于生长有利于表达呢？
谢谢
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guagua[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

估计你的蛋白对宿主菌的毒性较大，而且表达产物是可溶性的，所以用Rosetta后问题更严重，能告诉我你用的是什么载体吗？也许可以帮助你解决。
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近也遇到类似的问题，相同的条件，原来能诱导到上清的，现在却不行了，这个跟菌的新鲜的程度有关吗？
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是5X-1载体的。
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的载体是pRSET-C
不过开始在BL21中表达是包含体
但表达量不是很高
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guagua[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.如果蛋白需要量较大，建议更换其它载体如pET30a或pET28a(T7lac promoter含 lacI 编码基因)，这样稳定性应该会提高
2.如果蛋白需要量不大，那只能先保存一些质粒，每次做之前转化制备新菌种，或者做一下菌种传代稳定性的研究（如果是我做的话，倒不如更换载体）。
个人认为Rosetta不太适合于规模生产。
菌种的不稳定性现象很常见，原因较复杂，只能找些方法提高稳定性，祝好运！
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发表于 2014-3-17 22:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问一下你重新转化过BL21么?我也遇到类似的问题,表达菌种在-80保存了半年划线挑菌不表达,后来提质粒重新转化还是不表达,很郁闷,而且用原始质粒转化也没表达,可当初它确实是表达过的呀
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的，
会不会是你的BL21的菌株变异了，
我也碰到过这种情况，后来只能重新买NOVEGIN的新菌株。
TO adihua:
Rosetta不太适合于规模生产, 为什么？
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glass[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不会是菌株的问题,因为同一个实验室有别人也用的这个菌株表达没问题的
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实你们忽略了一个问题，就是BL21菌株中还带有另外一个质粒，是编码T7RNA聚合酶基因的质粒，而为何我们保存了好久的菌株拿出来想继续表达却发现没有表达图谱了？其中原因就是该菌株中的T7 RNA聚合酶基因被重组丢失了，那么你的表达载体上的启动子就没有用了。建议方法是，每次进行诱导表达前，可以用表达质粒进行转化后，第二天早上待重组菌长出并菌落较小时，挑取接种于液体培养基中，培养到OD600=0.8时，再转接至200ml或更大体积的液体培养基中，继续培养至OD600=0.8时，加入IPTG诱导，至于诱导时间需要自己摸索。这样可以保证表达的成功。
至于Rosetta为何不适宜用于工业化生产，其实与它的表达量有关的，试想一个菌株中拥有N多的质粒或表达框架在里面，那么同样的表达质粒导入，而在别的菌株中就只有一个表达质粒在里面，在相同的培养与诱导条件(即提供的材料量一样)下，可以想像Rosetta菌株中期望的表达质粒能用到的材料量占多少？那么你期望的表达量就肯定不会够了。至于我为何这么说，我已同时做了BL21(DE3)和Rosetta(DE3)为宿主进行表达我的目的基因，就会发现BL21(DE3)为宿主时表达量就会很大，相对来说Rosetta就小了。
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