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标题:【求助】天气冷,WB胶不凝,怎么办?

鹿奔奔[使用道具]
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1
 

【求助】天气冷,WB胶不凝,怎么办?

各位战友:
由于天气冷,我的WB胶不凝,为此,我采取了以下办法:
(1)开空调(30℃,实际温度可能达不到)配胶;
(2)调整胶配方:
分离胶 浓度 数目 溶液A 溶液B 双蒸水 10%APS TEMED
原方案 15% 2面胶 4.2ml 2.1ml 2.1ml 50μl 10μl
调整后 同上 同上 同上 同上 同上 70μl 15μl
积层胶 浓度 数目 溶液A 溶液C 双蒸水 10%APS TEMED
原方案 15% 2面胶 0.5ml 0.75ml 1.75ml 15μl 10μl
积层胶暂未配(请大家一起指正),但调整配方后的分离胶仍然不凝,我准备将灌好的胶放置在37℃烤箱中,不知是否可行?而或者,关于胶的配方方面,大家有什么更好的建议。
谢谢!
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october7[使用道具]
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胶的配方可以参考分子克隆。
放到37度没有问题。
你说的不凝是半个小时还是几个小时不凝,还是压根就不凝?如果压根不凝,也要尝试重新配置AP。
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鹿奔奔[使用道具]
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今天上午我尝试着做了一次胶(除10%APS和TEMED分别加量至80μl和15μl 外,其余配方与原方案一致),为检查胶到底是不是因为天气冷的缘故不凝,我分别将配好的胶液,一部分灌注到模具中去,一部分则仍然留在离心管中,并将前者放在37度烤箱,后者仍放在24度空调房中,奇怪的是,前者始终不凝,而后者半个小时左右便凝固了。
请问如何解释这种现象?
另外,我的APS是半个月前配好分装放在-20度冰箱中的,每次取出1支EP管做实验。
谢谢!
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mickeylin[使用道具]
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检查一下TEMED是否失效,换用新的试一下。
一般不凝的话就是APS和TEMED,还有就是温度
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检查一下TEMED是否失效,换用新的试一下。
一般不凝的话就是APS和TEMED,还有就是温度
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APS最好新鲜配置,一周内使用
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今天上午我尝试着做了一次胶(除10%APS和TEMED分别加量至80μl和15μl 外,其余配方与原方案一致),为检查胶到底是不是因为天气冷的缘故不凝,我分别将配好的胶液,一部分灌注到模具中去,一部分则仍然留在离心管中,并将前者放在37度烤箱,后者仍放在24度空调房中,奇怪的是,前者始终不凝,而后者半个小时左右便凝固了。
请问如何解释这种现象?
另外,我的APS是半个月前配好分装放在-20度冰箱中的,每次取出1支EP管做实验。
谢谢!
......

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基本排除是胶中各组分的问题,因为毕竟它在离心管中凝了。说句实在话,AP我们可以用1个多月都不用换。
楼主就照上述的protocol再次倒胶放置在空调房间,不用放进烘箱,延长时间看看。因为以前曾经看到有的资料上说胶的凝固需要光的作用,不知道有没有些许道理。
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whitesheep[使用道具]
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一般不凝,与AP 和TEMED有关。
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nikun230[使用道具]
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最近,我做了几次WB,胶总是不凝,而且容易漏胶。
我就把APS 和TEMED加大剂量:
APS TEMED
原剂量 60ul 6ul
现剂量 100ul 10ul
调整后胶凝聚效果很好。并且用胶布封闭周围取代以前用制胶夹的方法,胶不漏了,效果也不错。
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finger[使用道具]
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放烘箱里面37-60°都可以,温度越高凝得越快
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