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标题:【求助】酶活和Km值的测定

chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】酶活和Km值的测定


各位大侠.小弟现在正在做一个氧化还原酶活性和KM值的测定.利用其中一个底物NADPH在荧光分光光度计荧光值的减少量来求初速度.求KM值时把NADPH固定在200μM{过量},改变另外一个底物的浓度,(25 100 250 1000μM,估计该底物的Km值不超过1000),但是四个底物梯度的初速度非常相近,根本没办法作图区分.
而且我把酶倍比稀释到100倍,还是不能区分开,不知道为什么 请各位高手指点迷津,拜谢 请帮我分析以下结果
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

测km值虽然底物要过量,但也不能太多。像你这种情况明显是底物浓度过高,而你的酶km远小于25uM,根据米氏方程,[S]大大过量v=Vma×=k3[E],所以你测的初速度没什么区别。光稀释酶是没用的,你应该把底物稀释一下,接近km,同时适当稀释酶保证底物过量([E]<[S]),才能测出km
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢了.我再测一下试试,还有一个问题.就是我测酶活时,酶的量从0-25μg到10μg,初速度好象变化也不大,有的浓度低的比浓度高的速率还要高,请帮忙分析一下原因,谢谢
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那你有没有作过空白实验，只加底物和NADPH，有没有反应？
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我作空白对照了.对照没问题,不反应
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


你的实验是不是在NADPH和底物溶液体系中加入酶，然后测定荧光变化？这样就有一个问题，NADPH和酶的结合本身可能造成对其荧光强度的影响，就是说结合的NADPH和游离的NADPH本身荧光强度可能就有差别，这样你加入酶后荧光变化一部分都是因为NADPH与酶的结合。如果是那样，你可以改进一下，在平衡后的酶和NAPDH溶液中加入底物，当然你同样需要摸索以下底物的浓度，使之接近Km值之后在去测Km.
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

衷心的谢谢您给我解答问题 ,我加样顺序试过两种,一种是先加底物和NADPH,再加酶,另一种是先加底物和酶,后加NADPH,效果是一样的,我今天根据您的建议,我重新设置不加酶的空白对照,结果完全出乎意料,加酶和不加酶的荧光值变化几乎一样,而且比较大 我加100μM的NADPH,荧光值从60000降到54000多,真是不好意思,可能上次的空白对照因为粗心疏忽加错了,得到这个结果就是说明NADPH在空气中自氧化了么 ,或者说我得酶就没有活性了么,但是也没有办法避免呀,
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个容易解决，如果氧化不是底物而只是氧气造成的话，只要在体系中通大约半小时的氮气或氦气，就基本可将溶解氧清除，再加一层液体石蜡，加样时小心操作不要混入气泡，即可基本保证无氧条件（酶液可以离心一下除气）。
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是氧气.但是怎么在体系中通氮气呢,不可能把分光光度计中通氮气吧,加样过程也不可能无氧,我用的是黑色的酶标板,在荧光分光光度计中测的,而且溶解NADPH也是在外面,我想如果发生自氧化的话,配NADPH溶液时就开始氧化了,溶液在四度放几天早就氧化完了,但是文献上讲将NADPH溶液放四度两星期都不会分解,还有就是我这几天测的NADPH的荧光值都差不多一样(NADPH是五天前配的,放在四度),我解释不清楚为什么只有加入反应体系中才开始氧化,而且氧化曲线和酶反应曲线一样,开始速率比较大,然后变缓,敬请高手指点
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