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标题:【求助】怎样加一抗二抗的方法最科学

bling[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】怎样加一抗二抗的方法最科学


我一直在做western blot实验，但是每次做的时候转膜用立春红染色都可以看见很好看的条带，但是，可能是加一抗二抗的方法不是很好，所以实验的曝光结果总是不好，我想请问大家怎样加一抗二抗的方法最科学？最容易和目的蛋白结合。
我是这样做的，稀释一定比例后，将膜平铺在干净盒子上，膜下面滴上均匀的抗体，将膜覆盖后在在膜上铺上抗体，盖上一层塑料布，37度一个半小时，洗膜3次，再加二抗（加法同一抗），一个小时后，洗膜，发光。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的方法应该没有问题，关键是你的抗体用没有问题，如果你的抗体有问题的话，那就一定做不出来了。
还有你的膜有没有放反了。
同时也要确定你的发光液用没有问题，不能只考虑一个问题，你其他的问题是不是都排除了。
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发表于 2014-3-18 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“膜下面滴上均匀的抗体，将膜覆盖后在在膜上铺上抗体”，sorry,我怎么没看明白呢。
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bling[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜下面滴上均匀的抗体，将膜覆盖后在在膜上铺上抗体”，sorry,我怎么没看明白呢。
不好意思，写得太急了。就是说我先在要铺膜的地方均匀滴上抗体，然后把膜缓慢放在滴上抗体的地方，在膜的上方再铺上一层抗体。
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发表于 2014-3-18 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的封闭条件是什么？
如果封闭没问题的话，那就是你一、二抗反应的问题了，可能是一、二抗反应量不够。
可以买一些小盒子，或者是用比膜稍大的小培养皿，里面放稀释后的抗体5~10ml，至少需将膜完全覆盖，4度过夜。
不要心疼抗体，其实不浪费的，稀释后的抗体可以在4度放挺长时间的，你可以重复利用这些抗体，即不浪费实验经费，还可以省时间。
一抗反应最好在4度，可以延长你抗体的使用时间。
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发表于 2014-3-18 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以将膜放进小的保鲜袋里，加进去抗体后用封口机封好，我觉得这样做最节省抗体，只要加一两毫升的抗体就够了，如果你不放心的话可以适当多加一点，而且结束之后将口剪开，取出膜后里面的抗体可以重复利用。
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c86v[使用道具]
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发表于 2014-3-18 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵我和楼上的一样的，把膜封在和它体积差不多的袋子里，一抗4度过夜，第二天再在室温下2小时左右
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bling[使用道具]
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发表于 2014-3-18 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上各位的意见，最近我把系统重新配了一下，准备继续努力，希望有好的结果。到时有心得再与大家分享。
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bling[使用道具]
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发表于 2014-3-18 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的封闭条件是什么？
我一般是10%的脱脂奶粉37度两个小时或是4 度过夜
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-3-18 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"你的封闭条件是什么？
如果封闭没问题的话，那就是你一、二抗反应的问题了，可能是一、二抗反应量不够。
可以买一些小盒子，或者是用比膜稍大的小培养皿，里面放稀释后的抗体5~10ml，至少需将膜完全覆盖，4度过夜。
不要心疼抗体，其实不浪费的，稀释后的抗体可以在4度放挺长时间的，你可以重复利用这些抗体，即不浪费实验经费，还可以省时间。
一抗反应最好在4度，可以延长你抗体的使用时间。 "
一抗二抗均可重复利用吗？一般可重复用几次，我得一抗浓度较高，很是心痛那，多谢
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