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标题:【求助】western-blot 羊抗人的一抗，结果背景太高...

woshituzhu[使用道具]
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发表于 2014-3-18 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western-blot 羊抗人的一抗，结果背景太高...


小弟，在做COX-2的蛋白电泳，用的是santa的抗体，是羊抗人的，先是用牛奶做封闭液，并且用牛奶配置一抗，用ECL进行显色，曝光后背景太高，并且非特异染色比较多，无法分辨。后来，改为兔血清封闭，用TTBS进行配制一抗，出现了特异的染色，但是背景还是很高。二抗的浓度已经调到1:2500了，还是不行，背景高还存在。背景高，无法比较小的差别啊，苦思冥想，不得其解，请高手不吝赐教！
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2014-3-18 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一般封闭时间是2个小时，一抗孵育1个小时，然后4度下过夜，二抗孵育30分钟。期间的TTBS洗膜都按照常规弄的。但是，试了很多次，都是背景高。二抗的浓度，我1：800，1：1200，1：2500，都用了。背景虽然有些淡了，但是背景还是很高。结果分析起来，有困难啊。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-3-18 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

ECL 曝光，我最近也做，第一次背景很高，后来，1是改进洗涤注意每次都吸干洗涤液，2是提高二抗浓度到5000，3是减少曝光时间到8秒，10秒等。结果很好，没有背景杂色。还有就是MAKER上样量减少到4UL后，maker的背景色也没有了。
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-3-18 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢指教。每次注意把洗涤液都吸干净，这一点，我平时没有注意到。试试看，能不能有所改善。想问一下， 你用的一抗是什么抗人的？我的是羊抗人的，不能用牛奶封闭，也不能用牛奶配制一抗，因为我发现如果用的话，会干扰结果，几乎看不到特异性带。改为兔血清做封闭液，用TTBS配一抗，出现了特异性带，但是背景还是很高。不知道你碰见过羊抗人的抗体出现我这种情况没有？多谢
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-3-18 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 你作的是否为磷酸化的抗体，若是，5%脱脂奶粉封闭液会对结果产生影响，这时你可以考虑用BSA试试；
2. 背景比较高的解决方法：1）降低1、2抗浓度，我们用的晶美的2抗稀释度甚至达到了1：20，000；2）延长洗膜次数和时间；3）降低曝光时间；
祝好运
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2014-3-18 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的不是磷酸化的抗体.想问一下，羊抗人的一抗，用牛奶封闭或者用BSA封闭，会不会因为羊和牛的种属差异比较小，而出现交叉的抗原抗体反应，降低一抗的效价以及非特异条带增加，不知可否这么考虑？
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发表于 2014-3-18 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

二抗1:2500还是挺高的.我们实验室用的是1:20000.你在取二抗时不要把整个枪头都伸入到二抗的液面下，只要枪头的一点进入能够吸到就可以。而且要把粘在枪头外壁的刮去，否则可能远远超出你所配的浓度。如你取2ul，壁周围挂的都要超过2ul。
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 小中大
我想重要的还是浓度问题，因为首先你确定有带（不管是特异的还是非特异的）。然后降低浓度，包括样品浓度，一抗浓度，二抗浓度。我认为二抗浓度不是最终要的。我曾经降上样量从50ug·下调到5ug。另外一抗浓度也非常重要。建议多摸几个抗体浓度。至于洗膜，我觉得不是关键。
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发表于 2014-3-18 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为一抗的量和二抗的量有很大的影响！一抗后用牛奶封闭过夜，然后洗膜，还有就是用ECL进行显色时要注意浓度的问题。还有就是要看抗原抗体的可行性?
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flower-201[使用道具]
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发表于 2014-3-18 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景过高的解决方法：
1.降低抗体浓度，降低孵育时间，夏天气温高，同等条件下，抗体结合率很高，宜注意。
2.牛奶变质
3.牛奶封闭时间不够，我一般是室温封闭4个小时，或4度过夜，理论上越长越好
4.抗体特异性不好，结合效率不高，宜更换抗体，我遇到过这种情况
5.显影时间太长，在新配的显影液中，我一般5秒就行了
6.降低曝光时间，宜在黑暗条件下先看，如有明显条带，时间宜短
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