【求助】如何确定多克隆抗体的质量

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标题:【求助】如何确定多克隆抗体的质量

sr9971[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用重组蛋白（PET30a-重组基因）花了两个月免疫兔子，得到的多抗，western的结果识别重组蛋白（40kD），但是很特异的只识别多个组织中一条18kD左右的条带，明显太小，重复几次都是这样，郁闷阿，是不是我的抗体不大行啊？识别了其他的蛋白？还是这个蛋白在组织中被切断变小？想不明白,如何验证我的抗体是否好使，希望高手指点，谢谢了！

30moonriver[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，你要确定多抗的目的蛋白的分子量，40kda是重组蛋白的分子量，那目的蛋白多大呢？
其次，察看次目的蛋白的存在形式，有没有多聚体形式及变构形式；
最后，查看多家抗体公司的DATA，看看别人的WB做出来的条带的位置。
根据你说的，特异识别多个组织中的同样大小的条带，我觉得很可能就是你的目的蛋白。

sr9971[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢您！
我的目的蛋白是一种凝集素，具有两个不同的CRD结构域，1002bp开放阅读框编码333个氨基酸，怎么也得30多kda吧，假设是两个结构域被切断行使功能的话，那应该会有两条带阿，因为两个结构域不一样大，您说的查看抗体公司的DATA怎么做？到公司的网站可以查到么？

30moonriver[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有人贴过很多抗体公司的网站，你搜搜看，然后输入你的蛋白名称，就会有相应的抗体出来，查看抗体的WB结果就可以。
祝好运！

3648755[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我不是很在行，但我同事有一次做抗体，第一次注射和第二次注射得到的都不是正确条带，第三次注射之后正确条带才比较强地显现了。

sr9971[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这个抗体都注射了7针了，好郁闷阿，老师怀疑是蛋白在体内被切断了，也没发现有和我这样的情况的文章，我总怀疑是我的兔子不争气，或者我注射得蛋白量不够，是不是有必要重新作阿

二丫头466[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，你要确定多抗的目的蛋白的分子量，40kda是重组蛋白的分子量，那目的蛋白多大呢？
其次，察看次目的蛋白的存在形式，有没有多聚体形式及变构形式；
最后，查看多家抗体公司的DATA，看看别人的WB做出来的条带的位置。
根据你说的，特异识别多个组织中的同样大小的条带，我觉得很可能就是你的目的蛋白。
......

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可能18KD那条具有强免疫原性也是有可能的吧!!
其他的也该有微弱的条带丫~

sr9971[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其他也有微弱条带，但都40kda以上，30多kda那块儿超级干净

bs4665[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知你的目的蛋白是预测的还是已有人报道?

sr9971[使用道具]
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发表于 2014-3-18 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 bs4665 于 2014-3-18 17:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不知你的目的蛋白是预测的还是已有人报道?

没报道，是我自己扩出的基因，然后进行了重组表达

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