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标题:【求助】质谱问题求教

zbboom[使用道具]
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【求助】质谱问题求教


一维电泳染色后做二次质谱鉴定分子,报告出来一系列分子,但是分子量少了一半,他们解释说是蛋白修饰,如糖基化问题等,但是不会相差这么大把(50KD)?而且排在前面几个可信度高的分子,一看就不是啊。请各位高手解答,急等
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damingxia0904[使用道具]
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只要MS鉴定出来分数高的话,就可以确定是这个蛋白,至于表观MW和pI的差异,可以不用理会.因为蛋白有可能形成复合体(MW变大)、降解(MW变小)等等其他多种原因造成MW和pI的变化.
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zbboom[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 damingxia0904 于 2014-3-18 20:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
只要MS鉴定出来分数高的话,就可以确定是这个蛋白,至于表观MW和pI的差异,可以不用理会.因为蛋白有可能形成复合体(MW变大)、降解(MW变小)等等其他多种原因造成MW和pI的变化. ...

可是MS和WESTERN,IP相比较,分子量相差的这么大(50KD),不好解释啊
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jingling845[使用道具]
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质谱其实对样品纯度要求挺高的。由于你的样品来自一维电泳,理论上讲可能是一个混合蛋白,这样鉴定出来的就可能是一系列各不相同的蛋白。而且对于混合蛋白的鉴定,一级质谱的可靠性本来就差。
另外质谱的结果只是给我们提供一个参考,它并不能象WB或者PCR一样给予我们一个非常准确可靠的回答,质谱的结果往往是你所提供的样品中经过MS解析后产生的PMF中混合的肽段与目的蛋白中相匹配的肽段数是多少以及可信度是多少等等。所以最终还得通过PCR或者WB的方法对质谱的结果进行验证。
除此之外影响质谱结果的因素非常多。
因此建议楼主采用其他方法进行验证或者进行二级质谱解析。
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zbboom[使用道具]
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试验目的是找抗原分子,用的就是二级质谱啊,理论上是找出所有可能的分子,可是分子量相差太大,可信吗?还有什么方法啊,急啊
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bluelake[使用道具]
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我也遇到了lz的类似的问题。我的质谱结果中有两个蛋白分数分别是200多和300多,但是理论分子量远远大于胶中的位置。我考虑是不是蛋白断裂造成的。我想问:如果这样,那么分析这个差异蛋白还有意义吗?能否用蛋白的某一片段来预测整个蛋白呢?谢谢
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moonlight45[使用道具]
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Sorry I can not type in Chinese.
If 一维电泳 is SDS PAGE, one spot may contain multiple components. No matter what, the molecular weight of the protein from SDS PAGE reflects the real molecular weight of the protein except the protein is dissociated during denature or electrophoresis. The molecular weight of protein in database is the theoretical molecular weight predicted from sequence, where the signal peptide removal or various modification is not considered until it is reported by some paper. Thus the molecular weight is a very important parameter to Verify the modifications. For example, the theoretical MW of insulin or bovine serum albumin in database is more than their experimental MW due to signal peptide removal.
I think the result you get is very interesting. If database match gives very good score, one of the proteins may contain this fragment, but definitely, the protein given is not the protein you are looking for since such huge discrepancy on molecular weight, especially the theoretical MW much less than experimental MW. You could do a FASTA or BLAST homology search to see if there is any other proteins contain this peptide. However, this only can give you some clue, not the final answer.
There are several ways to verify:
1. get better separation of proteins using 2D gel or affinity(maybe more specific since you are looking for antibody, assuming you already know the antibody)
2. multiple peptides fragmentation in MS/MS to improve match, or using instruments with better mass accuracy.
If you could find proteins with multiple modifications, it will be more interesting. Anyway, good luck.
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quiqui008[使用道具]
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质谱鉴定出来的蛋白理论分子量比实际1D胶预测出来有差别是很常见的。
蛋白比理论分子量低:
1。通常是蛋白断裂(在生理条件被酶切断),或降解。
2。检索出的蛋白是蛋白前体, 实际上存在的是修饰过的蛋白。如果是蛋白前提,但报告的是蛋白,就是相反。
3。胶分离不好。 见下。
蛋白比理论分子量高:
1。蛋白量太大, 或胶跑的不好,造成蛋白分离不好,拖尾。丰度高的蛋白会在整个胶出现。 最多见。
2。蛋白修饰,会改变分子量, 但通常是使这个蛋白条带变宽。
3。蛋白前提, 没有修饰的蛋白会比检索的蛋白分子量高。
4。二聚体或多聚体形式。
所以你的监测的蛋白是在实际分子量2倍,一个考虑是蛋白分离不好,另外考虑是2聚体形式。 这都可以用western证实。
如果有做够的多的多肽片断,质谱检测蛋白是相当可靠的。 蛋白存在在与理论分子量相差很大的必定有其原因。
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quiqui008[使用道具]
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哦,对了。 我说的是指的你的质谱数据可靠,多肽和蛋白匹配都很好的情况下。 所以首先要确定质谱和检索是正确的。
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zbboom[使用道具]
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谢谢,怎么检测是聚体形式呢?一般来说跑胶后,二聚体间的二硫键是被破坏掉的啊
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