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标题:【求助】2D电泳样品制备时有必要加核酸内切酶么？

bgf5[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】2D电泳样品制备时有必要加核酸内切酶么？


bio-rad操作手册上建议每ml裂解液加150－300 u内切酶。
问题来了：细胞裂解液为高浓度的尿素，以及硫脲、DTT等，这些对核酸内切酶的活性没有影响么？我个人认为内切酶作为一个蛋白质，在这么高浓度的尿素作用下还能保持活性，简直是奇迹，因此，我没有加内切酶，但消化时感觉很黏稠。
请高手讨论。
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们的处理一般是待样品裂解完后，再根据具体情况看是否要用核酸酶
dtt对核酸酶有影响
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为不要加核酸酶，一是如楼主所说核酸酶在裂解液中无法发挥效能，二是本身就是一种蛋白质，有可能在胶上出现。
我们体蛋白的时候都是采用研磨加超声裂解的方法，超声可以打断核酸而不损害蛋白质结构，不过稍微注意超声的功率就是了，原则就是提取液不粘稠就可以，另外一个就是稍微多加点裂解液也会一定程度上改善提取液粘稠的情况。
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发表于 2014-3-18 21:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问2楼：核酸酶怎么个用法哦？直接加到样品里？
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bgf5[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tuuu2 于 2014-3-18 21:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我认为不要加核酸酶，一是如楼主所说核酸酶在裂解液中无法发挥效能，二是本身就是一种蛋白质，有可能在胶上出现。
我们体蛋白的时候都是采用研磨加超声裂解的方法，超声可以打断核酸而不损害蛋白质结构，不过稍微注意超声的功 ...


能否将方法说详细一点，准备参照。
我一般是加500ul裂解液，这么点东西不好超声的嘛。
碾磨倒是个好办法。
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发表于 2014-3-18 21:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #5 bgf5 的帖子

是细胞提蛋白啊，那就不能研磨了。
超声的话500ul是可以的啊，在冰上超声就可以了，3-5s后停顿3s，不要让提取液变热就行，最终不粘稠就可以用了。
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bgf5[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tuuu2 于 2014-3-18 21:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
是细胞提蛋白啊，那就不能研磨了。
超声的话500ul是可以的啊，在冰上超声就可以了，3-5s后停顿3s，不要让提取液变热就行，最终不粘稠就可以用了。

超声功率用多大？
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

LZ这么说也有些道理的，反正加了多少会对核酸的降解有好处，关键在于裂解后的高速离心，核酸不除，很容易堵塞SDS-PAGE
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

若组织样，只用液氮充分研磨不用超声破碎可以吗？
另外有没有不含蛋白的核酸内切酶吗？
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
超声功率用多大？

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100W即可除核酸，效果不错。在冰浴上操作。超声6S*4次，with 15S interval。
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