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标题:【求助】帮我看看我跑的tricine胶吧，问题多多

mercedes[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】帮我看看我跑的tricine胶吧，问题多多


我跑的是大约8KD的酸性膜蛋白，ripa强裂解液，BCA法定量，用的bio-rad系统tricine-sds-page，protocol就是附件一，坛子里大热的配方，用的2-71的marker，marker跑出来了，但是marker应该是7个，但是我总觉得是6个，反正后面几个很模糊，前面三个条带很细很清楚，就是在夹心胶的那三条很清楚，然后就是在spacer和seperating gel的界限处有很弄的一条蓝色，我感觉不像是条带，有些像想进但是进不了被挡在sapcer和seperating界限的条带，对了，三块胶我是先灌seperating，封水，一小时充分聚合后灌spacer，封水，一小时充分聚合后再灌stacking，然后进入到分离胶的很模糊两个条带，也说不清也许就是一个条带呢，最后一道就是非常宽的条带了，不知道2KD的到底拉开没有！！！还有就是只要marker旁边的LANE上样的话marker就会变形，比如跑斜了，或者错层了，如果marker相邻的LANE没有样品的话就比较直。图一LANE1是marker，后面我是为了试试普通的loading buffer和tricine buffer有什么不一样就一个LANE上routine的buffer，一个LANE上tricine的buffer，所以看着压不成一条线，我想问大家的就是为什么在stacking gel中不压成线而是跑的张牙舞爪的呢？好像孔道两边的样品最上面的不愿意往下走，像是挂壁一样，图2也是有一点，而且图2四个sample都是trincein 的buffer，中间两个lane的少，两边的lane上样比较多，结果就开始变形，图2是刚跑上不久，图3就是图2中4个sample进了seperating gel以后的情况了，都成帆船形状的了，我跑的时候一直都是30V，等指示剂跑到进了seperating gel大约一两厘米的时候就停，转膜是30V一个小时，结果就是没结果，大家帮我分析一下怎么回事啊
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发表于 2014-3-18 21:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图1，凑字，凑字


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发表于 2014-3-18 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图2，凑字，凑字，同时等时间，过30秒！


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发表于 2014-3-18 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图3，凑字，再等时间


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发表于 2014-3-18 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品是什么？可能是样品的问题。
1.如果你是用loading buffer裂解菌体，上样前要1200rpm离心10min再上样，不要将黏稠物加到上样孔中。
2.见议样品的浓度低一点。
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发表于 2014-3-18 21:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我样品是裂解的内皮细胞，上样浓度是20微克，但是由于浓度少体积都是三四十微升了，但是并不是粘稠，下次我会试试10微克的！谢谢！
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damingxia0904[使用道具]
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 小中大
我也有你同样的问题，但是船型出现是在最后，比你出现的晚一些。至今没做出结果。别说条带了，到了下面就只剩考马斯蓝了，根本没有蛋白。
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2014-3-18 21:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

样品如果是内皮细胞，加了loading buffer后反复吹打会很粘稠的(这是由于细胞被裂解后核酸释放出来造成的粘稠，枪头都会被堵)，若不粘稠的话说明细胞没有被裂解，换loading buffer或再加点SDS。
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mercedes[使用道具]
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 小中大
楼上同道，请问换成什么样的buffer啊？具体配方呢？加SDS到多大浓度？谢谢！
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chuntian1983[使用道具]
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 小中大

不好意思，刚看到贴子，做出来了吗？ 1*上样缓冲液的配制：
Tris碱0.61g + 蒸馏水80ml混合，调至pH6.8
SDS 2g
溴酚蓝0.1g
甘油10ml
定容至100ml
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