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标题:【求助】干扰素蛋白复性及免疫问题

fklo83[使用道具]
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发表于 2014-3-19 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】干扰素蛋白复性及免疫问题


请教各位几个问题：我用pGEX-6p-1做的干扰素蛋白表达
问题1：采用一系列不同尿素浓度的复性缓冲液进行复性，这一系列复性缓冲液可以重复利用吗？如果还有其他蛋白可以同时使用进行复性吗？
问题2：复性后，不经过过柱纯化直接进行抗病毒活性检测可以吗？
问题3：检测有活性后可以直接用来免疫动物吗？（同样是未经过柱纯化）
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发表于 2014-3-19 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.最好现用现配，因为使用后的系列缓冲液各种成分（尿素，氧化型还原型谷胱甘肽等）浓度改变，你根本不好确定下次复性时的准确条件，重复性不好把握；
2.不经过柱纯化，直接用融合蛋白进行抗病毒活性检测么？那标签GST怎么办，应该上柱后酶切再收集目的蛋白检测吧；
3.结论同上。
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发表于 2014-3-19 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我见有的论文就是用融合蛋白进行的动物免疫试验，没有去掉GST标签，但是基因不同，不晓得干扰素可不可以这样？
如果上柱酶切，具体试验操作能告诉我吗？我们这里没有做过的，不知道该怎么做，准备些什么试验用品？先谢谢啦！
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 小中大
动物免疫和活性检测是有很大差别的，有些实验中融合蛋白直接免疫那是为了提高蛋白本身的免疫原性，如果你的蛋白分子量不是很小的情况下，即使免疫最好也是酶切后再做。你的融合蛋白似乎要使用prescission protease酶切吧，你最好应该查阅下相关的小册子，上面介绍的很详细
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发表于 2014-3-19 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果将复性后的蛋白跑胶回收纯化，是不是蛋白就失去活性了呀？
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发表于 2014-3-19 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

针对GST融合蛋白，你复性后应该是上亲和柱，然后在柱上直接酶切，酶切完毕后，流出来的正是你的目的蛋白，理想条件下是这个结果啊，怎么还需要去跑胶纯化呢？
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fklo83[使用道具]
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发表于 2014-3-19 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是对上柱纯化不很了解，而且柱子很贵，怕做不好太浪费钱了，听别人说过有跑胶 回收的，所以又问了个与所讨论话题不太相关的，还请见谅呀！谢谢楼上了，我先回去好好学学有关上柱酶切这方面的知识，然后不明白的再向您请教！
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-3-19 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你太客气了。
亲和柱子虽然很贵，但可以反复使用的，只要你加样液每次都过0.45um膜对胶的损害是可以降低不少的。每种产品都有使用的有效次数，时间长了，胶的亲和效率肯定会下降。但我们做实验也是要选用最简单最有效的方法（有时候成本倒是次要的了），pGEX-6p-1载体的好处就是提供一个GST标签，使下游的纯化更容易。
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