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标题:【求助】western加完ECL显色液整张膜都特别亮

star#room[使用道具]
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发表于 2014-3-19 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western加完ECL显色液整张膜都特别亮


请问WESTERN高手:
我的蛋白21KD,膜蛋白,常规电泳,转膜(PVDF膜),立春红染色未见条带,将膜干燥,一抗1:2000稀释,37度孵育半小时,4度过夜,第二天再37度孵育半小时,TBST洗3次,每次10分钟,二抗1:5000稀释,室温孵育45分钟,TBST洗3次,每次10分钟,然后移到暗室,2.6*6.2的膜,A,B液各加600微升(北京普利莱的ECL试剂盒),孵育3分钟后关闭红灯,肉眼可见整张膜发光,可是暴光30秒,45秒,1分钟都没有任何条带出现,问题究竟出在哪里?请高手指教,不胜感激!!!
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avi317[使用道具]
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发表于 2014-3-19 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
丽春红染色未见条带的话是没转上去啊，21KD的蛋白比较小，电泳有没有跑出去，转膜是湿转还是半干转，是不是转膜时间不够，或者电流不够大，另外膜没封闭直接加一抗，一抗会和膜结合，导致整张膜都发光，一般我是3%BSA室温封闭2 小时，再铺一抗
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发表于 2014-3-19 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议用预染Mark，可以直观看到是否转膜成功，另外也要注意是否显影液、定影液过期了，都是一些细节
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发表于 2014-3-19 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

１．用了预染Mark的，11,17,26,34,43的条带都很清楚,就连72的红色条带都转过去了,转完膜的胶染色也证明转过去了啊
２．显影液和定影液都是在医院放射科要的，要回来的时候显影液就是黄的，请问有问题吗？
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发表于 2014-3-19 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有没有可能是TBST洗的不彻底呢?
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发表于 2014-3-19 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有可能显影液有问题，太黄了就是用的次数多了，可以试着曝光时间长一些，如果能见荧光，至少背景应该是有的
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发表于 2014-3-19 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问大家用的显影液和定影液是自己配制的还是买的成品呢?
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小糖块[使用道具]
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发表于 2014-3-19 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

显影液和定影液可以买成品，用时1：9稀释，又不贵。两瓶才40元。如果整张膜发亮可能不是显影液和定影液问题，你可以下次用DAB显色看看，有没有条带。不过显影液新的应该是清亮色的。
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c86v[使用道具]
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发表于 2014-3-19 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也有同样的困惑，我做WB，actin内参，100V转60min，5%BSA 4度封闭过夜，一抗天津津脉actin，1：200稀释，室温孵育1.5h，然后用TBST洗6次，每次15min，二抗天津津脉1：4000稀释，室温孵育1.5h，TBS洗4次，每次10min，用ECL（Perice）显影，压片1min，背景特高请高人指点谢谢！
还有一个问题，就是转完膜后用立春红染膜，什么也看不到，为什么？谢谢


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