蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】未知蛋白的鉴定方法都有那些啊？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】未知蛋白的鉴定方法都有那些啊？

newway[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76575
精华 0
积分 505
帖子 689
信誉分 100
可用分 4253
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
1

发表于 2014-3-19 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】未知蛋白的鉴定方法都有那些啊？


求助：未知蛋白的鉴定方法都有那些啊？请老剑客们指点啊！最好是每种方法有原理 步骤 及注意事项 万分感谢啊
顶部
caihong[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73197
精华 1
积分 795
帖子 1206
信誉分 102
可用分 6856
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
2

发表于 2014-3-19 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1, western
2, Edman sequencing
3. mass spectrometry
顶部
tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态 离线
3

发表于 2014-3-19 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.质谱法
原理：
一、利用MALDI-TOF质谱仪
根据肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质。
优点：
速度快，通量高，方法简便。
缺点：
灵敏度不足，可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。
肽段分子量精确度往往不够理想，影响鉴定结果。肽段分子质量在2000以上时，在MALDI-TOF-MS中的分辨率会有所下降。蛋白质数据库仍不完善。
二、利用ESI-MS质谱仪
由于MS/MS具有结构分析功能，可以获得检测到的每一肽段的序列。根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱(MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。
优点：
通过串联质谱大大增加了蛋白质鉴定的准确性。
对图谱的精确度和分辨率要求不如PMF高。
采用纳升喷雾提高检测的灵敏度。
缺点：
通量与速度不如MALDI。
数据库检索比较费时。
三、样品要求：
1、防止角蛋白污染
2、样品状态：液体、固体或胶内蛋白质（接受考马斯亮兰染色和银染样品鉴定）
3、含盐量： 挥发性无机盐< 20 mM; 不挥发性无机盐< 5mM
4、不少于200 ug /一块胶（银染）；
5、胶内蛋白质鉴定，蛋白质样品量不少于1mg/一块胶（考马斯亮兰染色）
四、蛋白质鉴定结果常见问题：
1、由于角蛋白等蛋白质的污染，造成鉴定为污染蛋白。
2、由于蛋白量过少引起鉴定结果的评分低，可信度不高。
3、由于蛋白质纯度不足，造成鉴定结果为混合蛋白质。
4、由于蛋白质为未知蛋白，造成鉴定无结果。
五、注意事项：
1、推荐采用考马斯亮兰染色。因为该方法的成功率较高，而银染的成功率则会低很多。
2、银染的方法为快速银染法。常规银染法不适用质谱鉴定。
3、考马斯亮蓝染色样品的上样量>1mg
4、银染法得上样量>0.6mg
顶部
tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态 离线
4

发表于 2014-3-19 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

2、shotgun 混合蛋白鉴定
原理：
针对液体或SDS-PAGE条带的复杂混合物用酶（Trypsin）酶解成肽段混合物，这些肽段混合物再通过液相色谱分离(如2DLC(阳离子柱SCX和C18反相柱串联)或1DLC 的C18反相柱)，再用串联质谱测试，然后在相应的数据库检索进行鉴定，可同时鉴定成百上千种蛋白质。
优点：
与传统的2D-gel比，一般的说来，Shotgun方法的灵敏度要高
缺点：
会丢失一部分翻译后修饰的信息
样品要求:
1. 样品量>300μg，浓度>0.5mg/ml
2. 含盐量<50 mM
3. 注明样品制备的过程及所用的裂解液成分
4. 注明样品的组成成分（是否含脂类、色素、糖等）
5. 注明是否可以用沉淀、透析以及超滤等来除盐及杂质

[ 本帖最后由 tuuu2 于 2014-3-19 14:56 编辑 ]
顶部
tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态 离线
5

发表于 2014-3-19 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

3、N端测序
原理：
蛋白质的α氨基与（PITC）在弱碱性条件下形成（PTC-）衍生物，后者在五水TFA下裂解，释放出N端（ATZ-）氨基酸，然后转化成（PTH-）氨基酸,这些衍生物用HPLC法加以鉴定
样品要求：
1、样品状态：可以是干粉，溶液或固定在PVDF膜上（转膜的蛋白质分子量<40kD,建议丽春红染色），注意不要使用NC膜（硝酸纤维素膜）替代。
2、样品浓度及纯度：N端测 总量>50pmol；纯度>90％；浓度>1mg/ml
3、含盐量：挥发性无机盐<20mM；不挥发性无机盐<5mM； 请务必标明样品缓冲液的成分，建议不使用Tris缓冲体系
顶部
tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态 离线
6

发表于 2014-3-19 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
补上：
常见影响测试的情况：
1、样品纯度不足
2、含盐过多导致无结果，甚至损坏仪器
3、样品量太少导致无结果
4、若蛋白质出现糖基化或N端被封闭，不能用此方法进行测
顶部
tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态 离线
7

发表于 2014-3-19 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

4、C端测序
方法：串联质谱法
原理：即在质谱中获得蛋白质肽段的碎片。肽段在质谱中的碎裂有一定规律，通常最容易断裂的是肽键位置，得到分别命名为b离子和y离子，得到这些离子的M/Z的图谱，分析图谱得到的蛋白质的C端序列。
样品要求：
含盐量： 挥发性无机盐<20mM；不挥发性无机盐<5mM
样品量：蛋白质总量>50pmol，纯度>90％
样品要已知氨基酸序列
常见影响测试的情况
1、样品不纯
2、样品量不够
顶部