【求助】（蛋白质电泳）临毕业小硕面临课题的关键问题

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标题:【求助】（蛋白质电泳）临毕业小硕面临课题的关键问题

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2014-3-20 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是研三的毕业生，现在面临课题的最后关键步骤--电泳测蛋白质的纯度，分子量，等电点，但是一直没条带。请各位大侠仗义相助，救小妹一把。下面请耐心挺我细细道来我的痛苦历程，希望不会太烦大家。
我硕士课题，把这种未知的酶类从某种植物中分离纯化出来，并且做初步的性质研究。
最初是分离，我最初就是透析出去小分子，再利用凝胶柱层析在280nm处收集组分，G200是在内水出来，也就是它的分子量大概是在400.000kd以上。
对于分离得到的酶类来说肯定要用电泳来验证纯度，测分子量，等电点，这是最基本的。于是我痛苦的日子开始。
最早我就跑了不连续sds-page胶浓度是15%，跑了无数次都没有条带，而marker跑的相当漂亮，我一度崩溃，甚至认为我的东西不是蛋白质，有一次无意帮我同学做sds电泳，上了一个自己的样，居然有条带了，只是上样量太大一片一片的。这让我坚信我的东西是蛋白质。
现在临近毕业，进入最后的性质研究阶段，我用sds胶浓度15%，12%，6%的我都跑了，结果都是marker有，我的东西什么条带都没有，好像人间蒸发了。
然后有跑了Page，先用的连续7.5%的标准胶跑了，为了有个对照加了个标准蛋白，结果标准蛋白跑的很好，我的东西什么条带都没有，于是今天又跑了醋酸纤维素薄膜电泳，第一次摸条件，分布让它跑了1.2.3个小时，结果三个薄膜染完色处理一看，那个点还在那里，根本没有动，我简直崩溃，是不是我之前所有做的电泳试验它都没有动，所以根本没有条带啊，但是我曾经跑出来过一次（帮我同学做那次）啊，上样量从2μl-20μg我都试过也就不是上样量的问题，这是为什么，我快崩溃了，现在面临毕业，换课题是来不急了，难道是我的课题前期立题就有问题？？而且我分离的样品也所剩无几了，555555555555555555
请高手赐教，为什么我的东西老是跑不出来，老是没有条带，但是marker都有，说明我的操作没有问题啊？？？感激不尽！

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-3-20 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵,给点意见仅供参考:
呵呵,给点意见仅供参考:
1、280有吸收的不一定是蛋白质，你最好先确定你纯化的东西到底含不含蛋白质，最好同时检测一下214nm、260nm处的吸收值，典型的蛋白质如果纯度比较高，214nm处的吸收值应该是280处的10倍左右，260处的吸收值是280的一半左右，你的样品可能纯度不高，这些比值可能不会这么准确，但是通过这个比例也可以简单判定是否是蛋白质的。
2、如果是蛋白质、上样前看看样品在加入上样缓冲以后是否有沉淀出现，有些蛋白遇到SDS时会出现沉淀，如果出现沉淀，再加入上样缓冲后尽量不要加热，或者改变一下你蛋白本身缓冲的pH离子强度等，这时沉淀的可能性要小些，楼主有一次跑出来了，可能与这个有关；如果没有沉淀出现，最好用还原缓冲、煮20min左右使蛋白充分变性、这样跑胶成功的可能性也会增加；如果用的是考染，没有显色，可以用灵敏度更高的银染试一试；跑SDS-PAGE时，看看浓缩胶和分离胶的交界处和溴酚蓝平齐的地方有没有蛋白染色，有可能胶的浓度不合适跑到最下面了或者在最上面没有下来。
3、不知道蛋白的pI，跑非变性PAGE很难成功，而且有的蛋白即便知道了pI，跑非变性PAGE，没有条带也很正常。
4、如果有条件，最好不要老盯着电泳，可以用HPLC也检测一下，跑个反向或分子筛的柱子也可以大体判断蛋白的纯度和浓度的。

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2014-3-20 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一条我一会就去实验室的层析仪电脑上查一下，第四条我也想到了，再不行我就没有办法了，我的样品快没了，我得毕业啊，实在不行就做hplc测纯度，用柱层析测分子量。
对于大侠提出的第二条我有些不太明白，“如果是蛋白质、上样前看看样品在加入上样缓冲以后是否有沉淀出现，有些蛋白遇到SDS时会出现沉淀，如果出现沉淀，再加入上样缓冲后尽量不要加热，或者改变一下你蛋白本身缓冲的pH离子强度等，这时沉淀的可能性要小些，楼主有一次跑出来了，可能与这个有关；”最早跑的时候我的样品（当时跑的是不太纯的样品）有出现过样品不溶于上样缓冲液的现象，就是不溶，我也不知道是不是出沉淀了，之后上的比较纯的样品倒是都溶了，就用上样缓冲液上的，我也没管它就上了样，请教大侠说的我跑出来那次和这个有关是什么意思？？？还原缓冲液又是什么东东？？
对于第三条，我实在是太赞同了，昨天用非变性样品跑了两次醋酸纤维素薄模的电泳一动不动，跑page它怎么可能动呢，今天我老板说可能是分子量大，跑不动，让我用sds的上样缓冲液处理，煮10分钟，让它充分变性，结果真的跑动了，染完了有东西，算是给我点信心，老板说这说明在这样的条件下跑sds肯定能跑出来，所以我上午又调整了思路决定跑sds，把胶浓度改成10%，样品煮10min，上样20μl，现在正在跑着呢，希望能成功吧，祈祷啊，上苍~~~~
ps：我们以前实验书上都说sds样品处理时煮3-5min，老板说要充分煮10min，说我就是偷懒，今天又挨了一通批，但是师兄师姐他们之前都是这么做的啊，请问煮的时间影响很大吗？

kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-3-20 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

400KD的蛋白用15%的胶很难跑动的，不同浓度的胶对应不同分子量的蛋白
丙烯酰胺浓度线性分离范围(kD)
15 % 12----43
10 % 16----68
7 .5 % 36----94
5.0 % 57-----212
另外，这么大的蛋白好像会比较容易降解，所以建议在四度下跑胶。我没有跑过这么大的蛋白，只是在园子里看过相关贴子，给楼主一个参考。
楼主跑完胶之后是直接考染还是做WESTERN？

huifeng0516[使用道具]
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小中大

ps：我们以前实验书上都说sds样品处理时煮3-5min，老板说要充分煮10min，说我就是偷懒，今天又挨了一通批，但是师兄师姐他们之前都是这么做的啊，请问煮的时间影响很大吗？

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书上说的东西方法对于大多数蛋白适用，但是对于某些二硫键较多，疏水作用力强的球型蛋白，这么短的时间很难使它充分变性，这时最好煮的时间越长越好！
还原缓冲就是加入了还原剂（DTT或beta巯基乙醇）的上样缓冲，这样能打断蛋白的二硫键，有些不加入还原剂很难跑出条带的蛋白，加入还原剂就可以跑出很漂亮的条带！

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发表于 2014-3-20 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不要怕，提高上样量，到60微克，试试看，我的一点经验

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发表于 2014-3-20 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是做考染，看条带，测蛋白的分子量啊，大侠说四度跑胶那不是要到冰箱里跑，那电泳仪怎么接进冰箱啊？？？怎么办啊55

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2014-3-20 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加大上样量~~

c86v[使用道具]
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发表于 2014-3-20 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大侠说四度跑胶那不是要到冰箱里跑，那电泳仪怎么接进冰箱啊？？？怎么办啊555！

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跑胶时温度不能太高，注意控制功率（即电压和电流的乘积），找到合适的不发热功率后一般不会发热的。电泳仪有的可以通循环水冷却，偶循环水系统可以在电泳槽中加入冰块，不一定非要放入冰箱！

831226[使用道具]
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发表于 2014-3-20 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

既然是跑变性胶，为什么不加入尿素或者盐酸胍？
估计蛋白跑不动的原因是蛋白的聚集太厉害，连上层胶都跑不进去。
BTW：
体外实验证明有酶活性么？如果没有，其他全白做了。