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标题:【求助】磷酸化蛋白WB究竟注意哪些条件？？

8s5g[使用道具]
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发表于 2014-3-21 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】磷酸化蛋白WB究竟注意哪些条件？？

我们最近两月都在做一个蛋白的磷酸化。
总蛋白已经能稳定的检测到，但磷酸化的始终不行。
我们WB的主要条件是：蛋白提取过程中加入磷酸酶抑制剂；上样20－60ug/孔都做过；51KD蛋白300mA恒流转膜3h；%3BSA封闭2h；一抗1：1000摇床4度过夜；二抗1：3000/5000/10000摇床室温1h。
请高手指点：磷酸化蛋白WB究竟需要注意哪些地方和环节？？
非常感谢！
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ending[使用道具]
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发表于 2014-3-21 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜时间过长了吧? 有预染Marker没有?看看是不是转过了 或是放两张膜 看第二张膜上有没有蛋白
一般52kD的话 300mA恒流转膜1-1.5h就够了
没做过磷酸化蛋白的WB,你们是先IP再WB,吗? WB完全没有还是杂带? 总蛋白的WB可以看到修饰条带吗?
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abc816[使用道具]
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发表于 2014-3-21 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先你必须清楚你的刺激因素能够引起目的蛋白的磷酸化, 为此你需要一个阳性对照, 比如akt的磷酸化, 你可以用insulin作阳性对照, 如果做不出来, 那就是技术问题或者试剂问题(商业化磷酸化抗体质量良莠不齐)了.
另外你的20-60ug的上样量不是很大, 有时候需要加到200ug.
还有正如楼上所述, 转膜时间可能过长, 不知道你膜面积多少.
磷酸化WB和普通WB一样, 只是多加入磷酸酶抑制剂而已. 不是你想象的那么玄.
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-3-21 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以先试一下免疫沉淀纯化一下蛋白,另外你做的是什么磷酸化?
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-3-21 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

"51KD蛋白300mA恒流转膜3h",如果是湿转，这和参数不合适。湿转51KD蛋白在100ｖ电压转移1ｈ就ｏｋ了。一般100ｖ电压湿转其电流也就是200-250ｍA之间，所以你的电流实在是太大了。磷酸化蛋白和普通WB区别还是有的，除了加入磷酸酶抑制剂，一般上样量也应该大点。而且磷酸化抗体的效价不同公司差别很大，所以我一般作磷酸化蛋白在配抗体时候稀释度少点，也就是抗体浓度大点。建议购买CST的磷酸化抗体，人家确实牛！
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发表于 2014-3-21 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问CST是指的Cell Signaling Technology吗？我用santa cruz 的抗体，最近磷酸化的蛋白出的也不理想。
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8s5g[使用道具]
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发表于 2014-3-21 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢各位的指点：
1)我做的是丝氨酸/苏氨酸磷酸化；
2)300mA湿转3.5h，非磷酸化形式的蛋白没有问题，但磷酸化的就是不出；
3)我们的一抗就是Cell Signaling Technology的；
4)有两次上样量大的时候，出现了条带，但分子量位置不对，有些怀疑是非特异条带(看来是很特异的，唯独分子量不合适).
5)上面有园友提出先进行IP，再WB，的确还没有这样做过。
感谢大家支持！！！
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2014-3-21 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问CST是指的Cell Signaling Technology吗？我用santa cruz 的抗体，最近磷酸化的蛋白出的也不理想。

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CST就是Cell Signaling Technology，信号传导的产品还是CST的好，尤其是磷酸化的抗体，santa的是抗体的大宗产品。
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bling[使用道具]
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发表于 2014-3-21 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是CST抗体，30V转膜过夜，一抗过夜，用上海康成的抑制剂。封闭奶粉用博士德的，百分百成功。
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