【求助】2-D奇怪问题求教

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标题:【求助】2-D奇怪问题求教

8黑眼圈8[使用道具]
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发表于 2014-3-23 21:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是2-DE菜鸟小妹，今天才做第一次。结果发现我昨天配的两管再水化液（含有IPG buffer），各2.5ml，-20保存，有一管冻住了一管还是液态，很是费解，因为以前没有经验所以只好又重新配了才用。
另外，还有个问题，手册上说让在使用之前每2.5ml加7mgDTT，可是我的胶条13cm，每次水花液只用250ul，该怎么加DTT呢？如果以2.5ml为单位加，在冻存后能再使用吗？
还在资料上看到说裂解液也要现用现配，若是-20保存融化后就不能再冻存了，是这样吗？这样不是很费IPG buffer？裂解液里可不可以不加IPG buffer？
问题太菜了，大家不吝赐教啊！！！感谢！！！

xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-3-23 21:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Q:我是2-DE菜鸟小妹，今天才做第一次。结果发现我昨天配的两管再水化液（含有IPG buffer），各2.5ml，-20保存，有一管冻住了一管还是液态，很是费解，因为以前没有经验所以只好又重新配了才用。
A:我觉得可能没有完全混匀，两管成份不同。
Q:另外，还有个问题，手册上说让在使用之前每2.5ml加7mgDTT，可是我的胶条13cm，每次水花液只用250ul，该怎么加DTT呢？如果以2.5ml为单位加，在冻存后能再使用吗？
A:2.5ml加7mgDTT，那250ul当然就加0.7mgDTT喽，不过有点太少了，基本上称不出来，你可以考虑用DTT储液，或者直接配到水化液中，效果是一样的，不用每次都现配的。
Q:还在资料上看到说裂解液也要现用现配，若是-20保存融化后就不能再冻存了，是这样吗？这样不是很费IPG buffer？裂解液里可不可以不加IPG buffer？
A:冻存几次不影响效能的，裂解液要加IPG buffer的，帮助蛋白溶解和稳定蛋白的等电点。楼主可能理解有个错误，DTT和IPG buffer不用只算到水化液，而是按你裂解液和水化液混合后的体积算DTT和IPG buffer就行了

8黑眼圈8[使用道具]
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发表于 2014-3-23 21:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上还真迅速啊，刚发就回了，感激！不过，我那两管的确是一个配方啊。anyway，还是谢谢赐教，我会在后面实验中注意的

okhaha[使用道具]
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发表于 2014-3-23 21:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是2-DE菜鸟小妹，今天才做第一次。结果发现我昨天配的两管再水化液（含有IPG buffer），各2.5ml，-20保存，有一管冻住了一管还是液态，很是费解，因为以前没有经验所以只好又重新配了才用。

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不知你配溶液的水是什么水，去离子水？双蒸水？你的试剂纯度很高，质量很好吧? 如果是这样，那么一点都不用担心，这只能说明你的试剂和水都太干净了，一点晶核都没有：）楼主不妨将没有冻上的管子用力甩几下，可能瞬间就冻上了。但这不影响效果的，放心吧！

okhaha[使用道具]
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发表于 2014-3-23 21:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外，还有个问题，手册上说让在使用之前每2.5ml加7mgDTT，可是我的胶条13cm，每次水花液只用250ul，该怎么加DTT呢？如果以2.5ml为单位加，在冻存后能再使用吗？

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建议你买Amersham的Destreak reagent，它是液体的，主要成分是DTT，还有其他一些去除点脱尾的试剂，你只需要向水化液中加几ul即可，很方便。

okhaha[使用道具]
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发表于 2014-3-23 21:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还在资料上看到说裂解液也要现用现配，若是-20保存融化后就不能再冻存了，是这样吗？这样不是很费IPG buffer？裂解液里可不可以不加IPG buffer？
问题太菜了，大家不吝赐教啊！！！感谢！！！

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这要根据你的蛋白浓度具体情况具体分析了。如果蛋白浓度很高，在做银染时，上样体积很少（几ul至十几ul），则裂解液中不加IPG buffer 也行。但如果蛋白浓度低，上样体积很大，就需要加了，否则会干扰水化液中IPG buffer的浓度，影响等电聚焦。

8黑眼圈8[使用道具]
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发表于 2014-3-23 21:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哇,楼上说得很详细啊,不过我甩过我的再水化液,还是没变化呀,水是是去离子的,试剂纯度还可以,不知为何碰见这种怪现象啊,不过,昨天已经做完第一次2D了,正在脱色,期待结果ing...

8黑眼圈8[使用道具]
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发表于 2014-3-23 21:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天有结果了,感觉我的样品裂解液还是有问题,我提的是植物蛋白,染出来小分子量蛋白很少,几乎没有,觉得不对,酸性大分子量的蛋白很多,聚集在一起,垂直方向有些脱尾,不知道是什么原因,下午附图上来,请大家帮忙分析分析

8黑眼圈8[使用道具]
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