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标题:【求助】Western Blot 转膜后染色

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发表于 2014-3-26 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western Blot 转膜后染色


这两天做Western Blot ，转膜后用立春红S染液染色5min，用TBST脱色，发现脱色非常迅速，我还没来得及看清条带，蛋白条带就已经看不见了，这是问什么啊？我染色5min后，到去染液，能清楚的看见蛋白条带，虽然背景是红色的。染液配方是：0.5g立春红S，加入1ml冰乙酸，水定容至100ml。谢谢！
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-3-26 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接用蒸馏水脱色，会退的比较慢
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发表于 2014-3-26 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问下，我也是用上述染液染膜，可是未见条带，可是转膜后的胶上只有少量条带，这是为什么呀？谢谢！
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发表于 2014-3-26 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
丽春红染5分钟就够了，不用要TBST褪色，用蒸馏水慢些，裁膜后用TBST洗3次×5min就可以去掉丽春红。to lucky4516：看不到条带，可能是蛋白上样量太少吧；或者转膜条件不好；实在看不到什么条带，可以用考染看看膜上有没有蛋白，不过考染是不可逆的，膜就废了。
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发表于 2014-3-26 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我转膜的条件是100V 45min,主要想测actin,我用的是BIo-Rad的mini型转膜仪。上样量是28μg 。曝光结果是白板。以前作出来过，现在不知怎么了压片过夜都不行，只隐约可见几条带。求救啊！最近做其它蛋白，会出现非特异带比目的条带强，不知为什么，大家帮帮我吧，谢谢啦！
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-3-26 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的转膜有问题吧，给个我的条件你参考参考。我是PVDF膜，100V，300mA 冰上转膜90－150min都可以，该条件我做过90－－27kd的转膜，都可以，你试试看。
Transfer buffer:
Tris碱 3.03g
Glycine 14.4g
Methanol 200ml
dH2O 800ml
Transfer:
a. 30V，90mA，4℃，overnignt（13hr）
b. 100V，300mA，4℃，1.5hr
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发表于 2014-3-26 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上的，固定电压了怎么固定电流呢？或者你把电流固定了怎么再固定电压？
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发表于 2014-3-26 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是恒流300mA,电压在90－110v之间波动都是正常的。
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发表于 2014-3-26 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

丽春红染膜的敏感性不太高，所以染色没条带，不一定最后没结果。楼上要是做的是beta-actin的话，应该比较容易出结果，转膜条件也很多，可能不一致，因为它表达量比较高，所以怎么做都可以出结果。如果是表达比较低的目的蛋白就要根据自己实验室转膜仪的性能摸索转膜条件了。
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发表于 2014-3-26 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们在实验中也发现这个问题，丽春红染PVDF膜效果很不好，一般都看不到，即使看到也非常浅，但是看不到不代表没转上。如果不确定的情况下进行下面的试验害怕会浪费抗体，所以拿考兰染膜，虽然膜费了但是可以摸转膜条件，因为这个也是很关键的，不同的蛋白，不同的浓度，不同的仪器条件差很多的。还可以用NC膜来做实验，它对丽春红很敏感。
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