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标题:【求助】ppic9k尝试用大肠杆菌表达,该选用哪种菌株?

youreyes[使用道具]
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发表于 2014-3-27 12:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】ppic9k尝试用大肠杆菌表达,该选用哪种菌株?


因目的片断连上ppic9k后,在酵母里没有表达,后来得知ppic9k也能用与原核表达,所以想尝试一下.但是不知道该选择哪一种菌株,请大侠指教.
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am10[使用道具]
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发表于 2014-3-27 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在ppic9k的说明书中说可以在Top10中表达，如果没有，用DH5a,也可以。
cuturl('http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppic9k_man.pdf')
上面的链接你可以下载到ppick9k的说明书，比较大，就不用附件给你了，我也有，不能下在再通知我
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-3-27 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在原核中可以扩增,但是真核和原核的启动子等等都不一样,怎么能表达出你的目的基因?
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发表于 2014-3-27 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室有用Bl21表达过的
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发表于 2014-3-27 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yjf1026 于 2014-3-27 12:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

在原核中可以扩增,但是真核和原核的启动子等等都不一样,怎么能表达出你的目的基因?

一般这种质粒两种启动子都有
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发表于 2014-3-27 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那插入位置和诱导剂是什么呢?
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发表于 2014-3-27 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Direct selection of Geneticin® resistance in yeast does not work well because newly
transformed cells need time to express sufficient amounts of the resistance factor. Since yeast grow much more slowly than bacteria, significant numbers of recombinant yeast are killed before they accumulate enough of the resistance factor to survive direct plating on antibiotic. Do not use Geneticin® resistance as a selectable marker. The procedure to generate Geneticin® resistant clones requires an initial selection of His+ transformants followed by a screen for varying levels of Geneticin® resistance. Resistance to Geneticin® conferred by the kanamycin gene present on pPIC9K is used as a SCREEN, not as a SELECTION for multicopy integrants.
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发表于 2014-3-27 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道云，说的插入位置指的是什么，原核表达不需要插入基因组阿，
原核细胞细胞中表达在这个体系中没有增强子，也没有诱导剂，在yeast中有，
因此，原核细胞细胞只是用来测试质粒，在表达其筛选抗性的同时会有目标蛋白表达，但肯定不是大量的表达。
强烈建议楼主重新看说明书......
因为yeast生长慢，可能楼主还没等到正确表达的时间。
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youreyes[使用道具]
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 小中大

如果用TOP10和DH5@,该用什么诱导啊?
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