【求助】Tricine-SDS-PAGE跑不动，而且溴芬兰变黄！

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标题:【求助】Tricine-SDS-PAGE跑不动，而且溴芬兰变黄！

duoduo[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友，最近实验遇到了困难，7kD多肽要用电泳检测，师兄说检测小肽要用Tricine-SDS-PAGE，可是我做了一个多月了，一直都没摸索好条件，主要问题是：
1. 跑不动（电泳2h溴芬兰才刚刚进入分离胶，继续电泳4h溴芬兰才到分离胶中间的位置）
2. 溴芬兰进入分离胶后约2h开始变黄
看了以前的帖子，分析原因可能是电泳缓冲液、凝胶缓冲液和上样缓冲液的pH不对，所以全部重新配的，而且全部一次性，没有重复利用，电泳时正负极间有气泡，说明电路的是通的（不过槽比较旧，接触不良，用皮筋儿勒住上盖就没事了），制胶用的胶条也撕掉了，这个因素也排除，我经验有限，实在找不出问题在哪。
为了让大家帮我分析原因，我把我的溶液配置、实验方法和电泳图发上来
1. 30%丙烯酰胺溶液
2. 凝胶缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 36.3g
SDS       0.3g
溶于80ml水，盐酸调pH至8.45，定容至100ml。2~8℃保存，3个月内使用。
3. 正极缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 24.4g
溶于800ml水后，盐酸调pH至8.9，定容至1000ml。4℃保存。
4. 负极缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 12.2g
SDS       1.0g
Tricine       17.9g
溶于800ml水后，盐酸调pH至8.25（未调时测pH为8.24），定容至1000ml。4℃保存。
7. 2×样品缓冲液（10ml）
浓缩胶缓冲液  0.48ml
80%甘油 5.0ml
10% SDS 0.8ml
1%溴酚蓝 0.2ml
1M DTT 2ml
水 1.4ml
制胶：
16%分离胶：（6ml）
30%丙烯酰胺溶液 6.4ml
凝胶缓冲液 4.0ml
甘油    1.6ml
10%过硫酸铵 60ul
TEMED    6ul
4%浓缩胶：（5ml）
30%丙烯酰胺溶液 0.67ml
凝胶缓冲液 1.67ml
水    2.50ml
10%过硫酸铵 50ul
TEMED    5ul
点样：以10ul/孔
程序1：恒压40v，至进入分离胶（约2.5h）
程序2：恒压100v（跑至分离胶一半约用4h）
固定，染色，脱色（这三步应该没问题）
请大家帮帮我~这步电泳对我的实验和毕业都非常重要~~~

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2014-3-27 22:32

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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 上样量太多。减少到1/5－1/10试试看。
2 电泳好像没有什么问题。tricine胶是要跑得慢一些，且胶浓度也大。你电压太低，自然跑得慢。如果玻板不会裂，可以直接100V电泳。我用北京六一的电泳槽（约8×10cm），都直接150 V。
3 溴酚蓝变黄，是因为pH低的原因。只要电泳分离好，影响不大的。

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 30%丙烯酰胺溶液
改为49.5％（Acr48.0g，Bis1.5g）
4. 负极缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 12.2g
SDS 1.0g
Tricine 17.9g
溶于800ml水后，盐酸调pH至8.25（未调时测pH为8.24），定容至1000ml。4℃
保存。
这个不用调pH配制后应该在8.3左右。
7. 2×样品缓冲液（10ml）
可以配成4x的
制胶：
16%分离胶：（6ml）
DDW 1.2ml
49.5%丙烯酰胺溶液 2.0ml
凝胶缓冲液 2.0ml
甘油 0.8ml
10%过硫酸铵 60ul
TEMED 6ul
点样：以10ul/孔（可以稀释2－5倍上样）
程序1：恒压40v，至进入分离胶（约2.5h）
程序2：恒压100v（跑至分离胶一半约用4h）
电压太小了，蛋白容易分散。可以直接恒流20－30V（根据自己的电泳仪选择）
固定，染色，脱色（这三步应该没问题）
嗅酚蓝变黄是缓冲偏酸了。不知是否与你调了缓冲的pH有关

yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的问题和有可能出在缓冲液上。如果PH没有调准，就会出现跑不动，发热量高的问题。

utt0989[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品中的氢离子浓度高了修芬兰就会变黄的

gogo[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的阳极buffer和阴极buffer互混啊,在电泳的过程中,做tricine电泳,要切记不能互混电极缓冲爷,你可把电泳内槽拿出来加入buffer,如果漏的话,则不行,一定要确保不漏才保证阳极buffer和阴极buffer不互混啊

duoduo[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品中的氢离子浓度高了修芬兰就会变黄的

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样品都是一样处理的，之间应该没有什么差别，而且都是在进入分离胶后才开始慢慢变黄，而且总是从中间向两周扩散呢？

duoduo[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的阳极buffer和阴极buffer互混啊,在电泳的过程中,做tricine电泳,要切记不能互混电极缓冲爷,你可把电泳内槽拿出来加入buffer,如果漏的话,则不行,一定要确保不漏才保证阳极buffer和阴极buffer不互混啊

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确实有点漏，不过漏得很慢。
我的电泳是自始至终都跑的很慢，难道漏过去几滴就会有那么大的影响吗？

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品呈现酸性，当指示剂了，哈哈，
重新配吧，我也范过同样的毛病

gogo[使用道具]
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发表于 2014-3-27 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

漏的话,你的阴极和阳极缓冲液就混了,PH就不对了啊,这和一般的SDS-PAGE不一样,混了还能用啊.
这个你看看,尽量不漏啊,其他的按照protocol来应该没问题的啊.

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