【求助】重组质粒变长了？

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】重组质粒变长了？

11 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】重组质粒变长了？

quiqui008[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 103466
精华 1
积分 310
帖子 295
信誉分 102
可用分 2271
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态离线

发表于 2014-3-27 22:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教各位大侠：
我把PCR产物（900BP）和pET32a（5700BP）载体用BamHI和HindIII双酶切，电泳鉴定并胶回收，然用用T4连接酶把它们按10：1的摩尔比16度连接过夜，连接产物同样电泳鉴定均正确。
然后用连接产物转化感受态BL21(DE3)，18小时后挑单个菌落做PCR鉴定有目的条带，然后摇菌提质粒，用BamHI和HindIII双酶切,结果发现我提的重组质粒大小约15000个BP，而且双酶切不开，为什么？按理说我的重组质粒应为6600个BP，为什么会变得如此长。

8s5g[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77636
精华 0
积分 469
帖子 538
信誉分 100
可用分 3626
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2014-3-27 22:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用BL21 DE3做克隆？绝对的不可取啊！
我怀疑你用BL21 DE3提质粒的时候提了基因组出来了，所以酶切的是基因组的片段。
先用克隆菌TOP10或者DH5a克隆好了再说吧。因为基因型的缘故，从BL21 DE3里面提质粒很麻烦的

quiqui008[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 103466
精华 1
积分 310
帖子 295
信誉分 102
可用分 2271
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态离线

发表于 2014-3-27 22:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢指点，我本来做了TA克隆的，但是失败了，所以我想直接将目的片断装进表达菌，原来这样做不行，那我再重做TA克隆算了，不过做了TA克隆后还不是要将片断切下来装表达菌，难道那个时候提质粒鉴定也不行吗？

mimili_901[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73543
精华 0
积分 564
帖子 723
信誉分 102
可用分 4458
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态离线

发表于 2014-3-27 22:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是你提质粒提的不好，用试剂盒再提一遍，然后酶切看看

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2014-3-27 22:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢指点，我本来做了TA克隆的，但是失败了，所以我想直接将目的片断装进表达菌，原来这样做不行，那我再重做TA克隆算了，不过做了TA克隆后还不是要将片断切下来装表达菌，难道那个时候提质粒鉴定也不行吗？

===============================================================================================================

您的整个概念还是有点混淆。
TA克隆不是用来做表达的（往往），当然也有一些公司做TA的表达载体，但我想你用的应该不是。TA克隆是把片段克隆到一种容易扩增的载体，这种载体通常带有丰富的酶切位点，适合在不同载体之间切换。而且TA克隆很容易，尤其是你的PCR产物比较难得，或者PCR两端的酶切不太好切（比如保护碱基过长等）时，人们往往首先将其克隆到TA载体上，然后测序，以后就只管酶切换载体了。
如果想往表达载体上克隆，有两种情况，一种是你要利用TA载体上酶切位点，这时候尤其要注意好好看看两者的图谱，不要切过去以后造成移框；如果你自带酶切位点在PCR产物两端，那么没关系，直接切了连过去，当然事先也要根据表达载体的阅读框设计好酶切位点。
无论TA克隆还是后续的换表达载体，都属于克隆工作，都是在克隆菌里完成的。
当你得到了你要的克隆（单菌落测序正确后），这时候你要保存这个克隆（质粒和菌），然后提取质粒，转化到表达菌。
Good Luck！

quiqui008[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 103466
精华 1
积分 310
帖子 295
信誉分 102
可用分 2271
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态离线

发表于 2014-3-27 22:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我以前本来将我的目的片断做TA克隆，我设计了两对PCR引物，一对含酶切位点，一对不含，扩增产物做TA克隆，分别用了两个T载体，一个含多克隆位点，一个不含，可惜这两个均失败了，然后我想将含酶切位点的PCR产物酶切后与同样酶切的表达载体连接，然后直接转表达菌，同样失败，提出来的质粒不是想要的重组质粒，所以酶切和测序均不正确，实验室有同学建议我将重组的表达质粒先转化DH5α，然后酶切测序，如果正确，将此质粒从DH5α中提取出来直接转化表达菌BL21（DE3），不知这种方法可不可行，因为我做TA克隆老是失败。希望你能帮我看看，谢谢。

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2014-3-27 22:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这就是我说的，你先要在DH5a里把克隆全做好，好好看看上面的帖子好吗？
克隆的鉴定有很多方法，比如菌落PCR，Cracking gel，酶切等。请搜索一下。
Bless

quiqui008[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 103466
精华 1
积分 310
帖子 295
信誉分 102
可用分 2271
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态离线

发表于 2014-3-27 22:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

麻烦你了。你说的克隆是不是特指TA克隆，如果我用表达载体pET32a来做克隆行不行？因为如果做TA克隆我必须要在PCR产物后面加上A尾。

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2014-3-27 22:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2014-3-27 22:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢指点，我本来做了TA克隆的，但是失败了，所以我想直接将目的片断装进表达菌，原来这样做不行，那我再重做TA克隆算了，不过做了TA克隆后还不是要将片断切下来装表达菌，难道那个时候提质粒鉴定也不行吗？

====================== ...

请注意一下上面帖子的斜体部分。

quiqui008[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 103466
精华 1
积分 310
帖子 295
信誉分 102
可用分 2271
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态离线

发表于 2014-3-27 23:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这下懂了，你的意思是说不论我将PCR做TA克隆还是直接连表达载体，都需要在DH5α中把克隆做好，然后再提质粒转表达菌（我用的是BL21DE3），是不是这个意思。

11 1/2 1 2 ››