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标题:【求助】转膜条件未变，为什么总是转不到膜上!!

veiwu[使用道具]
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发表于 2014-3-27 23:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】转膜条件未变，为什么总是转不到膜上!!


本人前一段时间 电泳 转膜 都很好，转膜后预染marker 在膜上很清楚，丽春红染后蛋白条带很清晰。中间有事耽搁了 。最近做了一次，转膜后条带不是很清晰，marker 也很模糊，我开始怀疑是缓冲液的问题，今天，重新配了电泳液 缓冲液，上样60ug,转膜后marker 很不清楚，丽春红染后蛋白也不清楚。转膜电极没接反，做三明治时液很好赶气泡了。为什么同样的同样的条件，以前转的很好，现在却出现这种问题，我反复差了几次 ，就是找不到原因。时间紧，任务重，老板 赶着要试验结果 。请各位大侠们帮忙分析分析，谢谢了
另，我用的是NC膜，目的蛋白60，转膜前在缓冲液里泡了十五分钟，180毫安，一个半小时，bio-rad 的湿转盒，转膜时盒里放冰块，这都是以前摸出的条件。
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发表于 2014-3-27 23:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近 两天又跑了几次 还是转不到膜上 。我开始以为是转过了，尝试了一次转两张膜 ，或是缩短时间，都不如以前的条件转的marker 清楚。膜上marker 很清楚，用立春红染没有一点蛋白条带，转完后把胶考染后没有一点条带。（我以前曾经转膜后用立春红染的很好。）而用同样的缓冲液和转膜槽 我同学的却转的很好。同样的条件，为甚么差别就是这么大，园里的朋友们你们有没有遇到这样的情况，实在是找不到原因了！！
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发表于 2014-3-27 23:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜前泡膜的缓冲液需要在4度冰箱中预冷;
储存NC膜的方法改变了没有;
缓冲掖的PH值要测定清楚.
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发表于 2014-3-27 23:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

缓冲液已预冷了，贮存NC膜的地方没变，就放在抽屉里 用封口膜包着，缓冲液的PH值大约是8.2
问题是用同样的缓冲液同一个转膜槽 我同学的蛋白转的很好，我的为什么就是转不过去呢,每次转完后 考染胶上没有条带，膜上李春红也染不出条带，（但是预染marker转过去了）而这些条件都是以前摸出来的，真不知道问题出在什么地方了。。
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发表于 2014-3-27 23:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
根据你叙述的情况,怀疑你目的蛋白降解的可能性比较大.主要基于以下几点:
1.预染marker能转过去,而且同事同样的条件转膜也很好,就基本排除你转膜的问题;
2.染胶上没有条带,有两种可能,一是胶上蛋白被转移到了膜上,另外可能是样本中根本就没有了蛋白,而根据你膜上也染不出条带,说明你的样本蛋白已经降解了.看看是否降解,你可以重新测一测样品中蛋白的浓度.
建议:重新制备蛋白样本.其它条件不变.
说明:一般制备好的蛋白样本最好当天作完;如果实在要存放一段时间,也要在最短时间内作完,个人经验是负70度条件时,不要超过两个月;液氮则可以稍长.
样本千万不可反复冻融,可考虑分装储存.
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veiwu[使用道具]
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发表于 2014-3-27 23:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的帮忙啊。可能是我没有说明白，
1 我冻的是细胞，做完模型消化后直接冻在负150度，至今两个月。
2一个月前我首次做wb，提蛋白后直接做wb，转膜后立春红染 的很好。
3，由于中间耽搁了一段时间，上周又开始做，细胞还是以前的细胞，新提蛋白直接跑胶，转膜，立春红染没有条带。我用的普利莱的蛋白提取试剂盒，裂解过程中，蛋白放在冰盒上已经注意温度了。我觉得，这样提的蛋白应该不存在降解问题吧
4，今周，我又重新从冰箱里取了组细胞，裂解后直接上样跑胶，转膜 ，立春红染还是没有条带。
5 若是蛋白讲解的问题，跑完胶后直接考染显示的蛋白条带很好啊
到底是甚么问题呢，真是心灰意冷了，，
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发表于 2014-3-27 23:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上的帮忙啊。可能是我没有说明白，
1 我冻的是细胞，做完模型消化后直接冻在负150度，至今两个月。
2一个月前我首次做wb，提蛋白后直接做wb，转膜后立春红染 的很好。
3，由于中间耽搁了一段时间，上周又开始做，细胞还是以前的细胞，新提蛋白直接跑胶，转膜，立春红染没有条带。我用的普利莱的蛋白提取试剂盒，裂解过程中，蛋白放在冰盒上已经注意温度了。我觉得，这样提的蛋白应该不存在降解问题吧
4，今周，我又重新从冰箱里取了组细胞，裂解后直接上样跑胶，转膜 ，立春红染还是没有条带。
5 若是蛋白讲解的问题，跑完胶后直接考染显示的蛋白条带很好啊
到底是甚么问题呢，真是心灰意冷了，，
......

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如果没有其它问题，考虑丽春红是否浓度降低了，重新配试试。
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发表于 2014-3-27 23:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主的问题很奇怪，胶都染不出来，说明电泳都有问题，本人的经验是不管你胶转膜转的怎么干净，用考马斯染染个个把多小时后脱色总会有带的，因为你转膜无论转的怎么干净，都会有遗留的蛋白都会被考染检测到，所以建议你第一步要检验你跑page胶有没有问题，建议你下次跑几个蛋白的page胶后不转膜，直接考染一多小时后脱色看看有没有带。如果没带就说明跑胶有问题，包括配的胶，蛋白的处理等等。接下来看在看看转膜的问题，在用立春红染膜前一定要将膜用去离子水津湿了后在用立春红染色，否则在脱色时是脱不出带的，就是红红的一片，不知道楼主注意没。如果不是就看看你的系统有没有问题了。
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发表于 2014-3-27 23:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以同时跑两块胶，一样的样品，一块考染，如果有东西，那说明是转膜的问题。
再攻关转膜的情况。有蛋白，但膜上没有，那就是转过了，缩短时间。
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veiwu[使用道具]
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发表于 2014-3-27 23:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果没有其它问题，考虑丽春红是否浓度降低了，重新配试试。

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开始我也以为是李春红的问题，重新 配的李春红染膜 也是没有条带
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