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标题:【求助】切胶做多抗

bluelake[使用道具]
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发表于 2014-3-28 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】切胶做多抗


纯化后的抗原SDS-PAGE后，切胶，可以做多抗吧。想试试这种方法，有谁做过，可不可以详细告诉一下，怎么进行切胶，需要哪些特殊处理，我要免疫兔子。谢谢
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发表于 2014-3-28 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接把它切下来!
1:你可以把它放入缓冲液后撵碎越碎越好!加热!利用扩散使它出来,胶碾细了可以注射就行了，我还见过连考蓝都没脱掉就去免疫的呢!
2:也可以放在透析袋中,放入水平电泳槽电压100,电泳4-6小时，在停止电泳前反向电泳15分钟。这样蛋白就在透析袋里的缓冲液里，可以通过透析换缓冲液或浓缩
3:六一卖电洗脱估计630元左右也是做这用的!
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发表于 2014-3-28 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bluelake 于 2014-3-28 15:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

纯化后的抗原SDS-PAGE后，切胶，可以做多抗吧。想试试这种方法，有谁做过，可不可以详细告诉一下，怎么进行切胶，需要哪些特殊处理，我要免疫兔子。谢谢 ...

单抗都可以用这种方法做，多抗肯定没问题。
切胶有两种方法：
一个是首先跑两块胶，一块染色，一块不染，然后比对着将目的蛋白切下，然后放入PBS中，在40度左右的水浴中可以将其溶解。
还有一个就是跑一块胶，然后用1M的kcl浸泡，20min左右可见明显乳白色条带，然后将其切下，之后的步骤同上
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发表于 2014-3-28 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

跑大胶回收目的蛋白，用kcl染色后会出现白色蛋白带，但在回收前先 跑个 小胶根据小胶上的marker确定目的蛋白在胶上的位置，根据小胶的蛋白带的位置切下大胶上的蛋白带，电洗脱的方法纯化蛋白
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-3-28 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有一个问题，切胶可以免疫；那用来检测抗体的抗原，也可以切胶么？
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bluelake[使用道具]
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 小中大
切胶免疫抗原的纯度应该是很高的，那么初次免疫兔子要用多少量呢（100ug可以么），加强免疫仍然减半么？
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xue258[使用道具]
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发表于 2014-3-28 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有一个问题，切胶可以免疫；那用来检测抗体的抗原，也可以切胶么？

==========================================================

可以。而且最好用于免疫时和检测该抗原产生的抗体时，抗原要保持一致。
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xue258[使用道具]
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 小中大
切胶免疫抗原的纯度应该是很高的，那么初次免疫兔子要用多少量呢（100ug可以么），加强免疫仍然减半么？

==============================================================================================================

100ng肯定不够，太少了。
一般来说，免疫兔子的抗原剂量为：首次剂量为300～500μg，首次免疫用完全佐剂。加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每2～3周加强免疫一次，加强免疫时用不完全佐剂。
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发表于 2014-3-28 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

什么是大胶。。。？
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王小主[使用道具]
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发表于 2014-3-28 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很多地方的胶有两种，不是大小，而是薄厚的区别；
一种1.5mm的，一种0.75mm的
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