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标题:【求助】关于蛋白质和mRNA

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【求助】关于蛋白质和mRNA


最近准备作实验,发现一个问题:就是蛋白质是功能的单位,那么我们为甚还要在mRNA水平去检测某一个目的基因呢?
为和不只是检测蛋白质就行 了嘛?
因为不论实验的期望是某一蛋白的表达升高或者是降低,在转录水平的mRNA应该是不能说明问题的啊。转录水平的变化并不代表蛋白表达的变化啊?
因为大家都知道在转录后翻译水平的时候受到很多因素的影响。
但是现在的文章都要么做了这两者,要么做了mRNA。好像是只是做蛋白的比较少。
我想问大家是不是就做蛋白水平的变化就行了?
这样的文章能不能说明问题呢?在本版上看了好像这就是蛋白组学的问题哈?
谢谢大家的教导!
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8princess8[使用道具]
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首先请修改标题,你这叫求助,不叫原创,谢谢你的理解和支持
我个人看法,mRNA代表基因转录水平,protein代表翻译水平,表示功能,常常还要做免疫组化,进行组织定位和亚细胞定位,三者不能互相替换,所以一般情况下三个都要做,影响因子小于5的文章一般就是这三个实验。
本版主要讨论蛋白质相关的实验问题,具体的实验策略讨论得比较少。
good luck!
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感谢你的指导!再向楼上的请教:为何都要做这三种呢?这样做的理论应该是什么呢?
其实我到处找都没有找到合适的地方表达我的看法和提出我的疑问,就在这上面来说说,要是斑竹觉得我的帖子不规范,请转移地方。谢谢!
我想要是实验策略方面都有问题的话,做的结果再漂亮也不能很好的说明问题吧,是不是呢?
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蛋白水平的变化很复杂的,包括磷酸化等一系列转录后修饰,都是对其功能的调控,因此其实研究某种基因的改变,仅仅在这两个方面也是非常肤浅的。蛋白功能的强化不仅可以表现在水平的增加,也可表现在活性的提高(磷酸化等),或者更新率(turnover)的提高。
虽然说mRNA和蛋白水平是一个相偶联的过程,但是两者没有必然的一致的趋势,因此不一定mRNA水平升高了就一定蛋白浓度就会提高,反之亦然。mRNA水平升高代表的是启动子或者增强子的激活,也许是上游转录因子的激活,而蛋白水平的提高则大多数和功能增强相偶联。机体是一个相互协调一致的整体,因此两者的变化往往是相互偶联的,因此验证两者的关系对于确认某个基因的激活是相当有力的。
免疫组化或者免疫荧光都是反应细胞内某种蛋白定位或者形态学上的一个大致的变化趋势的,并不能确切说明变化的形式,因此我认为如果缺少形态学的证据只要在蛋白水平验证即可,毕竟都是反应蛋白水平的,当然反应细胞内定位的情况就另当别论了。
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我只是宏观说一说,详细情况楼主说得很透彻,事实上采用什么样的策略和你的课题有关,一般情况下老板给出课题的大方向,你要围绕老板课题的预期实验目的来进行,一般来说,所有的人类,大小鼠的基因,前人多多少少都有做过,那么自己的实验自然不能重复人家已经做过的,需要有新的思路,具体怎么搞需要读大量的文献来实现,比如说是做转基因的,那么转基因前后northern blot实验恐怕是少不了的;做肿瘤细胞RNAi的,干扰前后细胞学变化的检测是必不可少的等等。
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受教拉!
感谢楼上的两位参与讨论和给予指点!
其实我也觉得到底做什么和实验的目的有关。
我是搞临床的。所以往往从临床的角度看问题。
我认为:除了在一系列的很基础研究中,要进行转基因等定位和mRNA表达检测之外,大多数的以“疗效”为目的的研究都只检测蛋白表达水平应该就能说明问题了。
因为无论研究是什么的目的,其结果最终大都应该是落脚到对机体功能的影响,那么这就是蛋白的水平了。试想无论在基因水平有什么样的变化,最后的蛋白水平没有变化,就说明这样的变化是“无效”的。(除外对其他基因的横向影响和联系)
有战友说目前的蛋白检测的技术水平不是很高,可能出现了基因水平的变化,蛋白也可能变化了,只是我们不能检测出。当然这也可能是存在的。但是我想一种因素要发挥作用,应该是与两个方面有关的:一是质;一是量。从目前的蛋白检测技术,就拿WB来说感觉水平也应该是够高的了,至少和临床上治疗用药水平比较来说已经是很高的了。我就想,要是在这样的水平上都还不能说明蛋白水平的变化,那么这样的“量”能够有多大的功能呢?又能对机体的功能产生多大的影响呢?换句话说这样变化的“疗效”何在?
因此,我对很多“疗效”性研究的基因水平的研究策略还是有点不太明白。
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qhyu[使用道具]
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7
 

我也来凑凑热闹呵呵
检测蛋白的量的变化,很多是有酶有mRNA的变化的大和明显。
我可以给你说一个我同学的稳重(准备中)。
某种植物在长期受到某种刺激后,体内某种酶的mRNA上调了几千倍,而酶的量其实没有那么大明显。然后他就找到了原因是间接的调控了酶的转录。这是一种很常见的调节方式。
所以检测mRNA很多时候让你更加知道真相的。
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8
 

如前所述,蛋白表达水平改变只是蛋白功能改变的一个侧面反应,很可能蛋白的功能已经有明显改变了但是表达水平也没有改变。举几个例子:
1. 小分子抑制剂,直接靶向于蛋白的pocket或者说小分子配体与其对应的蛋白质受体结合后,很可能就抑制了蛋白的功能,但是其表达的量很可能就不会变化甚至代偿性升高,难道这就是蛋白功能增强了吗?
2. 体内很多激酶,什么叫激酶?就是将一个蛋白的特定位点磷酸化,使其得到高活性或者失去活性。这是最经典的例子,很多药物也是通过激酶调控蛋白的,而非刺激蛋白表达。这仅仅是体内蛋白调控的冰山一角。此外泛素化、乙酰化很可能可以使蛋白降解或者失活,而还有通过氧化还原机制的蛋白活性调控。
总之,对于某种基因的调控,主要在两个层次一个是转录水平,一个是转录后(或者说是翻译后)水平,后者并不显著改变蛋白的表达水平,因此也是最快最直接的,在短期的调控大多属于此类,而在慢性或者持续性刺激的情况下出现转录水平的改变的可能性比较大。当然也有反例。
既然我们都知道蛋白质是功能的行使单位,为什么我们不更好的关注蛋白的功能而非表达水平呢?
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我理解的是赞同在“疗效”方面的研究中还是以蛋白水平的检测最能说明问题。但是为何那么多的研究还是热衷于检测二者呢?无论是国内的还是国外的都是这样。究竟是为何呢?当然,还有就是常常也加上了cake2003所说的免疫组化方面的内容。
不知道是不是这个意思?呵呵
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我也想问这样一个问题:蛋白和mRNA变化趋势相同说明什么意义,变化趋势不同又有什么意义?先做了蛋白有变化,为什么还要做mRNA是否有变化呢?做二者的目的各是什么?有什么文献支持?谢谢各位战友指点。
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