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标题:【求助】原核表达时多大的蛋白好表达

红茶可乐[使用道具]
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发表于 2014-3-28 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达时多大的蛋白好表达


各位大虾,请问做原核表达时多大的蛋白好表达?
我的基因全长3333bp，原核表达表达不出来，所以我打算选择一段来表达，，只做Ｗestern，不测酶活，大约多大好表达？是选基因序列特异的还是保守的？谢啦
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发表于 2014-3-28 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多选几段做克隆，反正一个牛牵着，两个牛放着。可能有的克隆不表达。
从几个KD到七八十个KD都可以，最好的是15-35kd。
应该是特异序列好些
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发表于 2014-3-28 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵，还是在序列设计和载体的选择上吧！对密码子进行优化一下，未必表达不出来的！
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红茶可乐[使用道具]
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发表于 2014-3-28 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位
不过我还是想问一下jackey0318,怎莫对密码子优化呀／？序列设计和载体选择？给俺多指导一下，这方面知识匮乏
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发表于 2014-3-28 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 红茶可乐 于 2014-3-28 17:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢各位
不过我还是想问一下jackey0318,怎莫对密码子优化呀／？序列设计和载体选择？给俺多指导一下，这方面知识匮乏

密码子最佳化（codon optimization） 　
遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，Pichia，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用。有趣的是，灵长类和酵母有6个同样的利用率低的密码子。大肠杆菌、酵母和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。因此，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响（尤其在异源表达系统中）的事实并不很奇怪。你的基因利用的密码子可能不是你正在利用的蛋白生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子，这种情况是可能的。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用率低的或稀有的密码子可以合成基因，基因的这种重新设计叫密码子最佳化。
在同源表达系统中，同较低水平表达的基因相比，较高表达的基因可能有很不同的密码子偏爱。通过对密码子利用的归类分析，人们可以真正预测任何基因在酵母中的表达水平。在诸如Zea mays的其他生物中，大量高表达基因强烈偏爱以G或C结尾的密码子。而且，在Dictyostelium中，同低水平表达的基因比较，高表达基因有较大数目的偏爱密码子。
在大肠杆菌中表达哺乳动物基因是不可预测和具有挑战的。例如直到最近才实现了人血红蛋白的过表达。为了达到血红蛋白的好的表达水平，Alpha-球蛋白cDNA不得不用大肠杆菌偏爱的密码子进行重新合成。在异源宿主中实现象血红蛋白这样复杂的蛋白质的过表达可能需要最佳化密码子，这些研究者为此提供了令人信服的资料。成簇的低利用率的密码子抑制了核糖体的运动，这是基因不能以合适水平表达的一个明显机制。核糖体翻译由九个密码子组成的信使（含几个低利用率密码子或全部为低利用率密码子）时的运动速度要比翻译不含低利用率密码子的同样长的信使的速度慢。即使低利用率密码子簇位于3'端，信使最后也会被核糖体”拥挤”而损害，核糖体又回到5'端。3'端低利用率密码子簇的抑制效应可以和全部信使都由低利用率密码子组成的抑制效应一样大。如果低利用率密码子簇位于5'端，其效应是起始核糖体数目的全面减少，导致蛋白合成中信使的低效率。散在分布的稀有密码子对翻译的效应还未很好地研究，但是有证据表明这种情况的确对翻译效率有负面效应。
其他因素也可以影响蛋白表达，包括使mRNA去稳定的序列。重新设计合成基因可以去除或改变这些序列，导致高水平表达。消除稀有密码子、去除任何去稳定序列和利用最佳密码子的基因的重新设计都可能增加蛋白产量，使的蛋白生产更有效和经济。
总的来说，成本就比较高了，要重新设计序列，进行人工合成基因了！
至于，载体的选择，我觉得选择N端带有诸如Gst-tag之类的促表达的融合蛋白，会使表达量显著提高的！
呵呵，我也是初涉原核表达，所以也是晓得这样而已～～
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发表于 2014-3-28 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

当然不能随便选择一段的。
首先你选择分段研究是正确的，这么大的蛋白即使表达了也是非常难以研究的，何况表达肯定很难，即使表达，包涵体的可能性非常之大。
其次，你选择的时候，首先应该预测一下整个蛋白可以分为几个domain
cuturl('http://globplot.embl.de/')
然后，将蛋白分成几个domain来研究，这样的好处是，蛋白容易折叠，而且会有可能保存着活性，从而可以继续后面的工作，例如，蛋白相互作用等等。
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发表于 2014-3-28 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"选择N端带有诸如Gst-tag之类的促表达的融合蛋白，会使表达量显著提高的！"Gst-tag＂是个什麽东东啊？我们实验室有pET-30a载体，感受态BL21．符合条件吗？
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 小中大
＂应该预测一下整个蛋白可以分为几个domain＂，怎麽预测呀？看了好多文章对这方面研究很少，自己通过同源性比较吗？好难
　给想个法子吧
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 小中大

我找到怎莫预测了　可是按照cuturl('http://globplot.embl.de/')这个网址预测后我的蛋白Prediction results for none，然后给了Disordered by Russell/Linding definition
>none_Disorder 195-199, 292-301, 351-355, 777-796, 811-821, 905-913和Potential globular domains (GlobDoms) by Russell/Linding definition
>none_GlobDoms 2-776, 797-1110
JOB-ID: none_074418olaMzQoBAY8AAFLOI4cAAAAB
Paramters: propensities=Russell/Linding smooth=10 dy/dx_smooth=10
Disorder frames: peak-frame=5 join-frame=4
Globularity frames: peak-frame=74 join-frame=15
Name: none
Description: none
Plot title/ID: none
Sequence length: 1110
Download Results smoothed raw dydx
什么意思呀？你快帮帮俺吧
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 小中大

你到ncbi，blast p，选择blast swissprot，找到你的蛋白是否在swissprot收录，如果收录了，里面详细信息非常又用。顺带做conserved domain预测，就看到你的蛋白有几个保守的domain。
到cuturl('www.expasy.org')(教育网cn.expasy.org)去，几乎所有的蛋白质分析都能做，或者找到链接。
载体用pGEX系列，也可以用pET-30a。
你这个案例去做密码子优化，大炮打蚊子，既没必要又没有效。
你说的只做 Ｗestern是不是指表达一段免疫动物，如果是这样的话，不需要太多分析，找20kd左右的一段（还是那句话，准备2到3个片断，就很有把握了），表达成包涵体也不要紧，可以免疫动物。
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