【求助】相当“美丽”的电泳图

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标题:【求助】相当“美丽”的电泳图

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发表于 2014-3-29 09:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位前辈：
我前天跑了一个SDS-PAGE电泳，跑出来就是这个结果，这可真是名副其实的“漂亮”啊，好像是跑出了几棵松树一样，还枝枝杈杈的，2、3、4、5条泳道我看着都像四个福娃一样，6、7两家又黏糊得不行了，真是服了，怎么能跑出这么奇怪的片子来啊？！
言归正传，我这个电泳是跑蛋白质水解液测其分子量分布的，选用的MK是4.1K-66K的，上海生工的产品，建议用15％的分离胶跑，应该能跑出9条带，前面4条还有模有样的，可是到第5条的时候就不行了，似乎是跟第2道之间发生拥挤或者扩散，而且到最后根本就没跑出来；
2、3、4、5条道是四个不同条件的蛋白质水解液，其中2和5尤其的差，干脆是弯弯曲曲的，问题是，为什么一条道上下粗细会不均匀，中间像跑出“啤酒肚”一样，颜色也不均匀，这个问题我前两次跑也出现过，但是这次更为夸张的是竟然跑出了“树枝”，到底是什么原因啊？
最后两道是没经过水解的蛋白质原液，干脆就是从一开始就粘在一起，为什么呢？
最后总的还有几个问题，需要请教一下：
1、明明是不同的道，应该各跑各的，可是为什么会之间发生莫明其妙的作用呢？这是什么引起的？是胶还是样品的问题？
2、15％的分离胶是按照书上配的，试剂都是现配现用的，我想不出还有哪有问题啊？
3，水解液和原液我是按照4：1与样品缓冲液混合的，因为之前样品少了跑出来颜色很浅，所以这次浓度加大了，但是我这个是成分不明的水解液所以我无法确定样品的浓度到底是多少，只能按照大概比例进行，我觉得这个配比不同只会决定跑出来后颜色的深浅不同吧，会影响其它的嘛？
以上是我看了这个图片之后一古脑冒出的问题，新手上路结果就碰到这么奇怪的问题，实在是百思不得其解，我觉得找不出原因一味的重复下去也没有什么意思，很是郁闷，所以不得不叨扰各位前辈，请帮忙分析一下好吗？非常感谢！！！

附件

2014-3-29 09:33

79602803.snap.jpg (24.39 KB)

小野花[使用道具]
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发表于 2014-3-29 09:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

先把上样量减到1/4--1/5再说。。。

junjie05[使用道具]
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发表于 2014-3-29 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你具体说说你这个胶是怎么配的吧...

NBA[使用道具]
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发表于 2014-3-29 09:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 小野花 于 2014-3-29 09:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

先把上样量减到1/4--1/5再说。。。

同意，
甚至建议减到1/20-30
同时把样品中盐离子浓度调成一致。

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发表于 2014-3-29 09:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位先！
我的上样量是20ul不到，以上二位的意思是我的这个量减少还是说上样中的水解液减少？
另外，我的分离胶是：凝胶贮液5ml，分离胶缓冲液2.5,15％的SDS溶液0.1,1%的TEMET溶液0.67,蒸馏水1.67ml，10％过硫酸铵溶液0.067
书上写的溶液混合后抽气10分钟，这个我没做，有影响吗？另外，十二烷基磺酸纳和十二烷基硫酸钠是一回事嘛？可不可以换用？

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发表于 2014-3-29 09:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你说的两个试剂是一回事，Sodium dodecyl sulfate，SDS
上样量的减少，你可以从你现在的样品中取1 ul稀释200，100，50，25，10，5倍进行剃度上样，看哪条跑出来最漂亮。就直接用loading buffer稀释，所以你最后load 的体积还是一样的。
你说量的时候，说体积是没有用的，因为不知道浓度。所以说20 ul是多了还是少了，还是不清楚的。关键是你这20 ul相当于多少组织（从多少组织中提取出来的），否则你下次体系变了又要重新来一次。或者测一个OD，有一个经验值，load多少比较合适。比如细菌，我都是10 ul OD600为2.5左右的菌，条带就比较清楚了。
如果你有定量，那更好。否则用A215测一测大概知道是多少蛋白，下次上样就有底了。
Bless

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发表于 2014-3-29 09:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢!!!我似乎突然有些开窍了，明天不用MK先把上样量给定下来！再次感谢！

fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-3-29 09:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从电泳图像来看，上样量大是其中一个原因，但它带来的后果往往只是泳道比较粗，蛋白带分不开情况。而上样样品的缓冲体系或离子强度不同（特别是盐浓度比较大的）会导致电泳泳道弯曲，即像2和5泳道的形状。其次还有上样样品的疏水性和亲水性的物理特征，也会形成泳道不规则的情形。因此在重新做电泳的时候，不光要减少上样量，药典中规定为10ug，还要尽量保证上样的样品比较纯，至少保证它们的缓冲体系尽量一致，离子强度尽量低，并且将疏水性强的样品尽量集中在一起，而亲水性强的集中到一起；或者离子强度强的集中到一起，离子强度弱的集中到一起等等，这样可以避免相互之间的干扰。
另外，树枝状的形状，说明了样品在电泳的过程中，蛋白质发生了变性，而导致迁移速度发生变化所致；泳道弯曲变形，说明是受到旁边的泳道的干扰所致。

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发表于 2014-3-29 09:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，老兄真厉害。
我也是新手，不过还没有这么夸张。
首先，我怀疑是胶的问题（AP和TEMED加了多少？），与上样关系不大；还有可能配的溶液也有问题吧，　不一定是配法，可能是水的问题，超纯水或双蒸水都有可能出现问题（我实验室就发生过水呈明显的酸性，使跑胶失败）

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-3-29 09:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，你的电泳系统没有问题，包括缓冲液、胶、电泳过程。
其次，可能样品上样量太大。同意2楼意见。样品要么稀释10倍再上20ul，要么不稀释只上2ul。
第三，确定样品中是否有高浓度盐或表面活性剂等。
第四，十二烷基磺酸纳和十二烷基硫酸钠是两个不同的化学试剂，分子式、分子量都不一样。sodium dodecanesulfonate CH3(CH2)11SO3Na,MW272.38; sodium docecyl sulfate CH3(CH2)11OSO3Na, MW 288.38。后者多个氧。

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