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标题:【求助】western blot 显色

remonte[使用道具]
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发表于 2014-3-29 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot 显色


我是做western blot的新手！有个问题想请教大家！
1，转膜后，用1x丽春光红染膜，未见条带！但用考马斯亮蓝染液染，可见条带，why？
2，免疫反应后，用DAB显色液显色，未见条带，但稍后用考马斯亮蓝染液染膜，可见条带，why？
3，本人用的蛋白（从原代培养的细胞中提取；上样量30ug）；pvdf膜；垂直电泳槽；湿转；一抗，二抗，DAB显色液均为博士德产品！
急切，等待你的帮助！
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-3-29 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.转膜后，用1x丽春光红染膜，未见条带！但用考马斯亮蓝染液染，可见条带，why？
丽春红对蛋白的染色敏感度不及考马斯亮蓝染液，你用考马斯亮蓝染色显示的条带较浅吧。
2，免疫反应后，用DAB显色液显色，未见条带，但稍后用考马斯亮蓝染液染膜，可见条带，why？
原因有目的蛋白浓度太低，灵敏度不够；或者条带不是你所要的目的蛋白，虽然条带位置可能对的，但相同或相似分子量的蛋白、多肽很多。
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发表于 2014-3-29 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1。用考马斯亮蓝染色显示的条带并不浅啊！
2。现在仅在做内参条带（actin），不会也有相同的吧？？（一抗，北京博 奥森的，刚到的货）
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KGZ564[使用道具]
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发表于 2014-3-29 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

考马斯亮蓝是用于染胶的，胶上有带，并不等于膜上有带，转膜后如果丽春红s染色没有带，几乎马上可以断定你转膜没有成功，后面的步骤都不必继续做了。建议考虑改变你的转膜条件，找找你转膜时是否有什么地方弄错了，比如电极正反， 膜的位置等。
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发表于 2014-3-29 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问你用的缓冲液是PBS还是TBS？
封闭液用的是脱脂奶粉还是BSA？
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发表于 2014-3-29 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

缓冲液一般用TBS，封闭液用脱脂奶粉就可以了，BSA太贵，western做的多的话太浪费了。此外有的特殊实验需要用BSA，不能用脱脂奶粉，如提取核蛋白进行western。
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发表于 2014-3-29 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本人用的缓冲液是TBST,封闭液是用的脱脂奶粉（完达山），经过许多人的好心相助，现在内参，还有一条目的带已出。原来是二抗的问题！呵呵，祝大家好运！
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发表于 2014-3-29 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问你用的TBST的配方和PH值是多少的?
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-3-29 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的二抗是因为浓度问题的吗？
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remonte[使用道具]
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 小中大

TBST tris 1.21
Nacl 8.77
Tween 20 0.5ml
双蒸水 1000ml
PH 7.5
Tween 20 最好现用现加！！！祝好运！！！
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