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标题:【求助】170KD的蛋白怎么弄？

kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】170KD的蛋白怎么弄？


我都郁闷死了。
我做了好些次170KD的蛋白western-blot了，修改很多参数，还是不出结果。
我用6%的分离胶、3.5%的stacking gel。 电泳100V 15分钟，后改为140V，50分钟。然后用低温低电压转膜（放在冰盒中，90mA12小时转膜），5%脱脂奶封闭1个半小时。1抗1：200（推荐1：200----1：1000 Santa Cruz）二抗抗鼠的1：2000。结果什么都没有出来，我觉得我已经尽最大努力了。
求助大家给点意见。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

附注：我的Marker 条带特别散，是跟 胶稀有关系么？？
我的样品是人脑组织匀浆后所得，已经用了多次，反复冻融了多次。
我在转膜过程中，由于换冰块，不小心碰到转膜仪，中断转膜一次。
我用丽春红染色，感觉看到的就是蛋白了，可是什么都没有。我明天把照片传上来。
如果需要，我把所有实验步骤详细写下来。
如果能有人指导，十分感谢十分感谢！！！！！
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bling[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上层胶有点稀。其实你就都用常用的积层胶就行，因为它的pH跟下面不一样的。
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bling[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，建议先做一个Dot-blot看看是否阳性，初步排除一下抗体的问题。
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daod[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们用北京六一厂的双垂直电泳槽 电压可以160V至溴酚蓝出胶
4％上层胶，下层胶平分为两层，上层6％或8%,下层12％
可用预染Marker指示条带位置及电转效果
电转用不含SDS和甲醇的电转液，冰浴 0.32A 恒流电转，6％或8％部分2h，12％部分1h
1抗可以试试1：500 4度过夜
最好同时作个阳性对照，如顺便把Actin杂出来，看看是不是TBST什么的有问题
总蛋白上了多少 这种蛋白在脑组织中的表达量如何
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.170 kd左右的蛋白我们一直在做呵呵,既然marker跑的不理想我想首先还是要先解决电泳问题;楼主可参考一下我们的条件:我们用的北京六一的仪器,用80V恒压跑stacking gel (浓度为5%),等30 min后进入resolving gel (浓度为8%)后换成120 V恒压跑大约1个多小时,这时候溴酚蓝基本上已经到底,而根据预染marker(购自MBI)170 kd的蛋白大概在resolving gel的上1/3,这时就可以结束电泳了.
楼主用的140 v恒压我们当时也用过,50分钟内倒是可以结束电泳,但是marker分离的效果不好,另外建议你还是跑5%的上层胶,8%的分离胶,我们用的一点问题都没有,而且小弟感觉如果胶太稀了,后面的转膜不太好操作呵呵(小弟手拙,就算是8%的胶也经常被我弄破)
2.转膜这一步我们用的仍然是六一的,恒流200-300 mA转2-3小时,根据小弟实验室的经验,转膜开始时电压大概在140 v左右,2小时后可能会降到90-100v,如果2小时后低于90,我们通常会延长时间至3小时以确保170kd的蛋白被转到膜上去. 小弟觉得楼主的90mA过夜似乎有点过了,印象中过夜的话用40mA就足够了.
3.block:现在是夏季,室温BLOCK 1小时也足够了.
4. 一抗,二抗的问题先不要着急,建议楼主先做个ACTIN之类的内参看看 结果,如果内参没出来,在确保你的标本没有出问题的情况下再去一步步排查每一个步骤和过程吧.另外想确认一下,你用的2抗是抗鼠的,那一抗呢?这一点最基本的可不要出错哦,如果一抗是兔抗人,那你选抗鼠的2抗肯定错了,呵呵,也许是我太小看楼主了,仅仅是提个醒,望见谅.
5.剩下的步骤我想就不用多说了,祝你好运.
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实在抱歉，我不明白什么是Dot-blot？
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电转液不用甲醇也可以么？其实我是刚刚开始学，不是特懂这个方面的知识。你们尝试过么？这个蛋白在脑子中表达不多，我上样量大概70微克左右。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的marker是bench mark的，就是大家经常用的第四条带是64KD的红色条带的那个。marker用了10微升。另外，我把NC膜在64条带附近剪开，上面用170KD的一抗孵育，下面用内参Actin孵育。还有，我肯定没有选错抗体，我选择的是santa Cruze的一抗和二抗。
谢谢。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-3-31 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我写一下自己的实验记录：
1、洗净玻璃板，擦干，安好。
2、配置6%分离胶并灌胶，后用水压平。
3、倒掉水，并用滤纸吸干后灌3.5%积层胶后插入梳子。
4、充分凝固后，准备放入running buffer和电泳槽中。
5、80微升+20微升5*上样buffer，100度加热5分钟。
6、上样。
7、电泳， 100V13分钟后调为140V60分钟。
8、轻轻取下胶，转膜。90毫安，12小时，放入冰盒中，低温湿电转。
9、轻轻取出NC膜，从63KD处用剪刀剪开，分别在右下角做一标记，5%脱脂奶封闭1个半小时。
10、丽春红染色，照相。
11：配置1抗， 1：200 4毫升。
内参： 1：800 5毫升。
12：上半部分膜与一抗孵育，下半部分膜与内参结合。封于自封袋中，4度过夜。
13：TBST洗脱 8分钟*3次。
14、配置二抗，1：2000。分别加入对应二抗。
15、 二抗孵育1小时。
16、TBST洗脱， 8分钟*3次。
17、用普利来ECL发光液体，A、B液各取2毫升，混匀，滴在膜上，
.....................暗室曝片。
18、顺便我把转膜后的NC膜发上来，请大家给与指导。
买的东西快用光了，可是老不出来条带，我疯了。
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