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标题:【求助】关于WESTERN时，加入ECL后膜的部分区域发黄

周伯通pp[使用道具]
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发表于 2014-3-31 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于WESTERN时，加入ECL后膜的部分区域发黄


不知道各位有没有碰到过这种情况：
原来我用的是国产的ECL,
在加完ECL后，膜上可见部分黄色条带，曝光时，可在相应位置获得较强的阳性条带。
但是现在改用井口ECL后
虽然也能见到黄色条带，但是曝光的时候什么都没有！
请问这个黄色的条带是怎么产生的？
是不是传说中的抗体浓度过高导致瞬间荧光卒灭？
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DONT[使用道具]
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发表于 2014-3-31 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的也有微弱的黄色条带，但曝光结果还算满意，应该不是“传说中的抗体浓度过高导致瞬间荧光卒灭”，因为我的条带亮了很长时间。
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发表于 2014-3-31 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个事情有点诡异了，按说你用的是进口的ECL，不至于呀。建议再做一次试试，多加点ECL，排除淬灭可能。你用的哪个公司的ECL啊？
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guagua[使用道具]
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发表于 2014-3-31 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

小弟当时做actin时也出现过这种现象，HRP太高（2抗）超速催化底物生成的产物使膜发黄！（当时用的精美的2抗浓度为1：2500，）另外加上ecl后膜上出现黄色条带 压出的片子可以是正常的，也可以是弱信号或者无信号！还可以是反影(白色条带,黑色背景) 其原因分别为：
弱信号或者无信号：在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物！解决办法：加入底物后迅速进入暗室，压片10秒钟！或者降低2抗浓度为1：5000。
反影(白色条带,黑色背景) ：条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。解决办法：加入底物后迅速进入暗室，压片10秒钟！或者降低2抗浓度为1：5000。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是弱信号或者无信号，解决方法同上。
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-3-31 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也有过这样的情况
我们实验室都认为是信号太强所致，通俗的说就是“烧膜”
并且曝光结果都是条带中对应膜上黄色的部分是空心的
解决方法是降低上样量或者稀释一抗，或者在二抗中加奶粉

[ 本帖最后由 taoshengyijiu 于 2014-3-31 17:23 编辑 ]
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-3-31 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也碰到你所说的情况。如果烧膜了，胶片有感光，那应该降低上样量或稀释一抗；我碰到两三次，膜都明显烧黄了，胶片还是没感光，你说的“.......导致瞬间荧光卒灭”，好像也是个愿因，但是我后来一样的条件重做，没出现这现象，不知道是什么原因。你重做一次，看看吧！
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周伯通pp[使用道具]
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发表于 2014-3-31 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

MILIPORE的ECL灵敏度太高了。
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周伯通pp[使用道具]
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发表于 2014-3-31 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这种情况有没有可能于一抗的浓度有关？
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-3-31 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分析得很透彻，很赞同！
我们用的 PIERCE的二抗，HRP标记的抗兔：1：20000； 抗鼠 1：10000
洗涤时间长点 我们通常要洗1 个小时！缩短曝光时间通常不能得到质量好
的片子，最好是在稀释2抗或者更换灵敏度低的ECL显影底物!、
一抗影响不是很大，最多增加了背景和非特异性结合，不会出现膜烧黄
的现象
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