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标题:【求助】哪位有提取组织蛋白的好方法?

大脑门儿儿[使用道具]
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【求助】哪位有提取组织蛋白的好方法?


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胃癌
小弟是新手,头一次做WB,胃癌的标本,怎么样提取蛋白效果好些呢?
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remenb[使用道具]
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组织中总蛋白的提取:先用PBS洗去血污
1、 将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、 加400 μ单去(或三去)污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。
3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、 裂解30 min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
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c86v[使用道具]
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胃肠组织的标本单单用PMSF是不够的,应该再加一些蛋白酶抑制剂的,比如说leupeptin,aprotinin,否则很可能做不出你想要的蛋白。特别是楼主取的癌组织,我想比较珍贵吧。建议你参考一下paper上的具体方法。反正小弟是深有体会,组织裂解不好或者蛋白提取不成功很让人郁闷:(
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whitesheep[使用道具]
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我提的是脑组织中蛋白,效果很好,量也很多,你可以参考一下。
组织中蛋白质的提取
1.  准备工作:
准备冰盒,枪头盒入4度冰箱预冷;
准备1套1.5MlEP管,2套0.5MlEP管并写上标记放入冰上,加样枪;
配制细胞裂解液与PMSF,比例为10:1,入4度冰箱保存。
2. 将匀浆器放入冰盒内,加入一定量细胞裂解液;
3. 从液氮中或-80度冰箱中取出组织,一个组织一个组织匀浆,用微量加样枪收集匀浆器中的细胞裂解液至1.5ml EP管,冰浴30分钟。
4. 超声1s,间隔5s, 连续5次(以不粘稠为准),样品超声时安置于冰浴中,以免产热;
(注:超声柱子要用双蒸水冲洗干净,再用70%乙醇擦拭1-2次,用双蒸水冲洗干净,最后用纸巾擦干)
5.  离心,4度,15000rpm, 1h;
6.  用预冷的枪头小心取上清,避开脂质,移入写有标记的0.5ML EP管中,并分装20Ul至另一0.5Ml EP 管中(定量用)。放入-70度冰箱保存。
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yjf1026[使用道具]
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请问楼上是做的那部分脑组织?我想做下丘脑的?能否用?
用超声的步骤能不能改为冻融法,液氮反复冻融?
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uaubc[使用道具]
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我做的是海马和皮层的,下丘脑应该也可以用,关于超声这一步能不能改为冻融,我没试过,不过你可以尝试一下,看提取出来的蛋白纯度怎么样。
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