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标题:【求助】蛋白挂不上镍柱。

remonte[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白挂不上镍柱。


求助大家一个问题：我现在在表达一个蛋白是在pET15b中表达的，在N端有His tag，蛋白表达量很大，而且在37度，IPTG浓度是1mM的时候也是在上清中，这与我原来表达的 蛋白不同。但是我在纯化上清过Ni柱时却怎么也纯化不出来，实验没办法进行了。我用的咪唑的浓度是500mM。柱子没有问题，因为别人用的时候纯化的很好。希望大家给点建议。
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3648755[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 蛋白质折叠错误，His tag标记没有暴露出来
2.在上几步分离纯化时，蛋白断裂使His tag丢失
3.上游质粒构建有问题
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以做个western检测一下his-tag
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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 小中大

最好测一下序，却定蛋白的读码框是正确的啊。
蛋白不挂柱的原因有很多，建议搜索本版，一般buffer的pH、成分会影响挂柱。
histag丢失的可能性也是存在的。
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remonte[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家的意见!我先改变条件多试一下!
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也可能是蛋白折叠不正确，可能His tag没有暴露出来，可用低浓度的盐酸胍溶解一下样品，然后过柱子！
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

到底是蛋白不挂，还是挂得太少？
可以结合过夜，加大柱子的量试试。
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nut6694[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
把你的胶直接加在你的上清里饱和吸附,试试
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是这种情况,都折腾了3个月拉,还是不行,
还请高人多指点下啊
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

确认蛋白有his-tag以后，可以采用变形上柱，柱上复性的方法，即可
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