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标题:【求助】利用confocal来验证蛋白与受体的结合

qiangren789[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】利用confocal来验证蛋白与受体的结合


在我的实验中，已经初步发现一个蛋白A可能是通过平滑肌细胞膜上的一个常见受体B起一类生理生化作用的
想要一些直观的图象证据，我想问的是：
可不可以分别用A、B的抗体结合二者，再用不同颜色的FITC标记的二抗去分别结合两个一抗，confocal下观察两种颜色荧光的位置，来验证设想。（当然抗体的来源尽可能分开，以免干扰）
可能存在的问题：
抗体的空间阻断。在我概念中，在活体细胞上，蛋白与受体的结合不会很紧密，我这么做是否有问题？
由于我对这技术以前从无涉及，诚恳请有confocal经验的战友指导！！
（回帖有帮助的战友一律pm赠送原创高权ez或vpn等）
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49888[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
confocal下观察两种颜色荧光的位置，来验证设想
如果荧光重合，并不一定说明两个蛋白发生呢相互作用！例如常见的这样的做法可以证明两个蛋白在细胞内共定位，但是不可以就此推断这两个蛋白发生了相互作用！
第二：你推断的蛋白相互作用发生在细胞膜上，要观察共定位有不小的难度，这样做出来的证据可靠性不是很强的！
如果要直接的活体证据，可以试试荧光共振能量转移（FRET),具体方法可以自己查查！
祝顺利，试验有进展一定的分享哦！
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主这个问题有点难度哦！免疫荧光一般来说用固定细胞的，因为常规做的都是胞内蛋白，没有固定的细胞膜的通透性很差，不能让抗体通过胞膜的，而且没有固定的细胞抗原表位暴露也不是太好，抗体结合可能不是太好，这样做很可能有假阴性。但是鉴于版主的蛋白是在胞膜，有可能还是可以做出免疫荧光的。我觉得在做的时候用固定和活细胞分别做看看有没有什么区别，我想这个应该是能够做到的。
至于两个抗体的间接免疫荧光，我认为这个设想应该是可以的，但是可能需要在步骤上改进一下。首先当然是直接免疫荧光比较好，能够最大程度上的避免干扰，其次我觉得尽管抗体来源不同之间的交叉反应可能也是无法避免的吧，我觉得可以序贯孵育两种抗体，也就是说，先孵育一种一抗和其对应的荧光二抗，再孵育另一种一抗及其对应的荧光二抗。不知道以上拙见对版主大人是否有帮助？祝好运！
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is2011[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 49888 于 2014-4-1 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
confocal下观察两种颜色荧光的位置，来验证设想
如果荧光重合，并不一定说明两个蛋白发生呢相互作用！例如常见的这样的做法可以证明两个蛋白在细胞内共定位，但是不可以就此推断这两个蛋白发生了相互作用！
第二：你推断的蛋白相 ...

另外也在用siRNA干扰掉这个受体 看此蛋白的作用是否还在
confocal是另一佐证
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发表于 2014-4-1 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 huifeng0516 于 2014-4-1 10:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主这个问题有点难度哦！免疫荧光一般来说用固定细胞的，因为常规做的都是胞内蛋白，没有固定的细胞膜的通透性很差，不能让抗体通过胞膜的，而且没有固定的细胞抗原表位暴露也不是太好，抗体结合可能不是太好，这样做很可能有假阴 ...

感谢提供帮助！
1、固定细胞的问题，我提个想法你看看有可能吗。比如我将蛋白和细胞共孵育一段时间，然后固定，二者将保持结合的状态。再上抗体，如何？
2、序贯孵育两种抗体。那在孵育第二种抗体的时候，第一种二抗的荧光还会在？ 或者是不是在先孵育一种一抗和其对应的荧光二抗后，confocal扫描后，再洗脱，再孵育第二种抗体，再confocal，最后重叠图象。这样做的难度恐怕不小啊，起码显微镜找原来那个细胞就不容易了
不知道说得对不对？
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 可以，如果你的A蛋白不在细胞内存在，或者只有在某种诱导的情况下才会结合B，那么无论如何，只要你认为二者发生结合的时候就可以对细胞进行固定，固定处理应该都会将二者固定于原位的。注意选择固定剂的种类，常用的有醛类的（2%甲醛或多聚甲醛）和醇类的（甲/乙醇，预冷固定）和丙酮（预冷，在玻璃器皿中固定）；
2. 一般来说，在常规的操作环境中，间接免疫荧光可以持续1个月左右，完全能满足要求的。不需要一个一个上显微镜观察的。选用的两种二抗所偶联的荧光最好吸收波长差别大一些，以免串色。
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is2011[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、A在胞内表达。。如果A在细胞内也有表达，那么固定细胞就会使胞内胞外都显色，就会有干扰。那么就不能固定来做？
2、我的A蛋白的C－terminar是带有6个组氨酸标签的，那么一抗可不可以选择抗组氨酸标签抗体，二抗的选择性就比较大了。这样做的话有没有优点？
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-4-1 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 is2011 于 2014-4-1 10:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、A在胞内表达。。如果A在细胞内也有表达，那么固定细胞就会使胞内胞外都显色，就会有干扰。那么就不能固定来做？
2、我的A蛋白的C－terminar是带有6个组氨酸标签的，那么一抗可不可以选择抗组氨酸标签抗体，二抗的选择性就比较 ...

1. 一般来说如果是胞外游离的A可能就不能显色了，结合在膜上的A很可能也可以检测到的。这个与固定不固定应该关系不大。
2．His标签的抗体直接标记的很多，这样确实选择就大多了。如果是His标签的间接荧光标记二抗应该选择也比较多。
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yes4[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人感觉，这个思路不是太好！·楼主的问题不简单的。
我倒觉得楼上的意见比较中肯.
既然初步发现蛋白A可能与一个常见受体B起作用，不知有无免疫共沉淀结果？！如果有，再加上荧光共振能量转移技术应该能说明问题了。
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is2011[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 yes4 于 2014-4-1 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
个人感觉，这个思路不是太好！·楼主的问题不简单的。
我倒觉得楼上的意见比较中肯.
既然初步发现蛋白A可能与一个常见受体B起作用，不知有无免疫共沉淀结果？！如果有，再加上荧光共振能量转移技术应该能说明问题了。 ...

倒不是我发现的
只是在一种新的细胞上看看一篇science的结果，那篇science比较有争议。science上的手段是受体结合实验
我用siRNA干扰掉受体B后，初步结果发现二者确实有关联。但只有siRNA的结果我觉得可能不够丰富
免疫共沉淀和荧光共振能量转移技术对于我来说可能太复杂，一时半会也可能作不好
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