【求助】我的抗体为什么做不出来？

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标题:【求助】我的抗体为什么做不出来？

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友，我最近一直在做western blot，但总是没有结果。虽然条件优化了很多次，但是效果仍很不理想，所以请教一下各位，请大家帮忙分析一下。
下面是我做western blot的条件
目的蛋白分子量：29kd
样本组织/细胞名称：人胃癌细胞蛋白样品
目的蛋白表达亚定位（胞膜/胞浆/胞核/分泌型）：胞膜；胞浆
一抗品种：单抗；一抗公司：UPSTATE 公司
一抗质量评价：第一次自从开始做western blot，从未作出来过；后来让公司换了一支抗体，似乎有条带，但很不清楚。
分离胶浓度：5%
加样孔底面积（宽×厚）： mm× mm；上样量：10ul
转膜方式：半干转；
转膜强度：恒压×时间：20v×20min
封闭液名称：5%牛奶TBS ；
封闭温度和时间：室温20min
一抗说明书推荐稀释度：1：500 ~1：2000
使用稀释度： 1：500；
一抗反应温度和时间： 4度过夜
二抗说明书推荐稀释度：1：1000到1：3000 ；
实际使用稀释度：1：2000 ；
二抗反应温度和时间：室温1.5小时
洗膜时间×次数：洗三次，分别为10分钟、5分钟、1分钟
显色（时间）/显影（压片时间）：用DAB 显色
结果描述:没有出现目标条带，或者很模糊隐约的一条

ending[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的感觉:
1. 上样量小了点,建议上到20ul-50ul看看;
2. 分离胶改为12-15%;
3. 提高一抗和二抗的浓度,建议提高1倍;
4. 如有可能改为ECL法显色;
5. 尽量使用分子量Marker来标记目的条带的正确位置.
总的来说你的条带可能有可能没有,有的话很淡,很有可能是由于蛋白表达丰都较低造成的,因此可以通过加大上样量,提高显色底物的敏感度,提高一抗二抗的结合力来增强最后的条带.此外还可以加做一个阳性对照看看是否是由于细胞本身的原因造成的条带缺失,供参考!

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的建议如下，供参考：
1.  分离胶的浓度太小，12％是较合适的。
2.  上样量偏小。不知道你的蛋白浓度是多少，建议你综合考虑上样体积和蛋白总量，保证蛋白量在30-50 ug的同时上样体积为20 ul以下。在此体积之下上样量越多越好。
3.  我一直是做的湿转，对半干转膜没有经验，听听其他人的见解。
4.  脱脂奶粉的浓度没有问题，但是封闭时间太短了。我不知道你的从哪里知道的室温封闭20 min，但是，我还是要pp你，我做了十几年的试验，还没有看到任何一个中外的文献报道做WB只需要在室温下封闭20 min！在室温下封闭至少1 h，甚至4度过夜。做实验之前应该多查文献，了解每一个实验方法的每一个参数！
5.  也许是你没有说出来，在一抗孵育之后是需要用TBST充分清洗的。再有，我觉得你清洗的次数和时间都需要增加。我是TBST 10 min╳4次。一抗和二抗之后都是如此。
6.  还是换成ECL吧，否则不但自己的实验难做出来，将来发文章也会受到各种“刁难”的。建个暗室应该不难的。
7.  祝试验顺利

owanaka[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

半干转的话，16V20MIN就可以了，20V20MIN很有可能转过了

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先要感谢各位战友的中肯建议，其次要说句对不起，需要改正几点错误，因为我这个调查表是从别的地方直接考过来修改的，有的地方没有注意到：
1.我使用的分离胶浓度就是12%的，显色用的其实是ECL显色法；
2.转膜后我一般都丽春红染色标记抗原蛋白位置；
3.室温封闭20 min是抗体说明书上推荐的，洗膜说明书也主要让用水洗，我用TBST 洗过，可只要用TBST 洗超过10分钟，最后显影就是一片空白，连背景都没有；
4.转完膜后我一般都丽春红染色，膜上在目的蛋白的位置是有条带的。
真的非常感谢各位的关注和帮忙，祝大家开心健康！

S6044[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚刚看见楼主的帖子。"室温封闭20 min是抗体说明书上推荐的"，是做免疫组化的封闭参数吧？做WB一般都不会推荐这么短的时间。

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 zranqi_1 于 2014-4-1 11:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

首先要感谢各位战友的中肯建议，其次要说句对不起，需要改正几点错误，因为我这个调查表是从别的地方直接考过来修改的，有的地方没有注意到：
1.我使用的分离胶浓度就是12%的，显色用的其实是ECL显色法；
2.转膜后我一般都丽春红 ...

目的蛋白的位置处有蛋白并非就一定是目的蛋白，据我的经验一般来说Marker的区分并不能非常精确的显示每个条带的确切分子量。（说句不好听的话很可能在你看到的以为是目的条带的位置的上下有可能存在不可见的真正的目的条带）毕竟丽春红的敏感性不算是太高的。
封闭20min确实是短了些，不过鉴于你没有做出明显的条带，这个条件可以暂时不用优化，但是用双蒸水洗膜这个确实没有听到说过，而且我认为没有出条带就是因为用TBST洗膜？我想可能是归因错误了！
既然是ECL法的话，显影定影就非常重要了，如果在暗室里看到了非常弱的条带，就算是非常弱，也应该能压出来的，因为人的眼睛肯定没有胶片敏感嘛。建议考虑一下显影和定影系统有没有问题，很简单，只需要做一个阴性对照和阳性对照就行了。两张胶片，一张曝光，一张直接放入显影液中，定影后看胶片的颜色，如果曝光的那张都是透明的，显影液就有问题了，换掉！显影工作液一般室温下避光最多6个月，而存储液可以到一年，但是都是推荐经常更换以获得更好的条带。

zranqi_1[使用道具]
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小中大

关于我的抗体封闭时间的问题：这是我的抗体说明书（见附件），请看一下，不知道是不是我理解有错误；

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.确实丽春红只能大概显示一下目的蛋白附近是不是有蛋白，确定不了是不是就是我的目的蛋白，可我也没什么办法能确定了，连最后显影都出不来，很是郁闷。之前怀疑是抗体的问题，让公司换了一支，还是不理想；
2.关于显影定影系统的问题,因为我同时也显β-actin，没有问题，所以这套系统应该没有问题吧？
PS：今天又显了一次，还是隐隐约约好像有条带，显影时间为20分钟，同时做的另一个抗体显影效果就很好，郁闷致死~~~不会是RP这么差吧？

am10[使用道具]
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发表于 2014-4-1 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了你的抗体说明书，首次看到推荐封闭20 min，首次看到用“ wash with water”，大开眼界，学习中..........
upatate应该是相当不错的大公司，现在已经归属于millionpore旗下，应该是对其说明书负责任的。但是，人家的推荐你是可以修改的，所以你可以考虑并不完全按照说明书作WB。
既然能够看到微弱的荧光，应该是WB没有什么大问题的。我再建议你考虑以下几点：1. TBST是否配制有问题。你说一用TBST洗膜就熄火，是否在配TBST的时候tween 20的加入量太多。再确认一下。配好的TBST放在冰箱中，每次用的时候保证TBST都是冷的，这样对抗体有好处。2. 抗体过夜可以。建议在加入1抗之后先在室温下轻摇1 h，然后再放入4度冰箱过夜。第二天拿出后先在室温下轻摇0.5 h再洗膜。3. 显β-actin既然没有问题，显影与定影就应该是没有问题的。4. 还是有可能你的蛋白丰度不高。下次提取蛋白用RIPA buffer，同时用6倍loading buffer，加大上样的蛋白量。只能是边摸索边找原因边改进，我当初就是这样煎熬出来的。不要急，功夫不负有心人的！最后解决了，对你而言真就是一笔财富了！

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