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标题:【求助】蛋白诱导表达前后一样?

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发表于 2014-4-5 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白诱导表达前后一样?

请问哪位战友遇到过在蛋白诱导表达前后一样的情况.我以前是有做出来的.而且WESTERN-BLOT已经鉴定过了.急等回复
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发表于 2014-4-5 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你的质粒是在BL21菌株中长期保存的，有可能出现这种情况，建议长期保存质粒还是应该把它转化到扩增宿主中，如DH5-alpha中，还可以保存一些高浓度和高纯度的质粒。
遇到这种情况你可以将现有的细菌划板，挑单克隆出来提取质粒，重新转化，表达量应该没有问题的。
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发表于 2014-4-5 12:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 2541 的帖子

我以前一直在做表达,他非常不稳定
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发表于 2014-4-5 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我已经重新转化 ，情况还是 相同。真是郁闷 啊 ！我 这个是要着急毕业的东西。请各位战友多多帮忙 ！
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birdfish[使用道具]
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发表于 2014-4-5 12:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
遇到过你的这种情况，BL-21存在本题表达的情况。可能是你的本题表达的问题。IPTG不起作用就很正常了
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abc816[使用道具]
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发表于 2014-4-5 12:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知楼主的菌株是什么抗性的，如果是AMP抗性的可以观察一下你的平板上菌体的形态，看看是否有卫星菌落出现，如果有卫星菌落出现，应该是倒平板加入AMP时温度太高，使AMP失效；或者在37度培养箱中放置的时间过长（大于16小时）造成的，此时再挑取菌落诱导表达，因为在平板上时AMP的选择压力已经降低，质粒丢失情况严重，这样再诱导表达肯定受影响。
我们也经常出现同批保存的菌种，表达时有时无的现象，后来我们发现是在平板培养时出的问题，楼主在平板培养时注意加入AMP时培养基的温度和37度时培养的时间。或者可以将保存的菌种溶化后直接吸取一部分加入培养基中培养诱导表达，这时应该表达出来的机会要大得多。
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发表于 2014-4-5 12:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的战友,我的菌是卡纳抗性的
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mercedes[使用道具]
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发表于 2014-4-5 12:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果 诱导前后蛋白都表达的话,很可能培养基质量问题,带有乳糖的缘故
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