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标题:【求助】为什么marker蛋白出了条带而要检测的actin却没有显现

mercedes[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么marker蛋白出了条带而要检测的actin却没有显现


我是第一次做WB，用的是－80储存的大鼠脑皮层的匀浆过的样品，我加了不同的量，抗体用的是actin,可是结果marker蛋白有条带，而要检测的样品的内参结果都没出来！郁闷啊！而且X光片上还有一些圆形的发白的空泡，不知为什么，请高手多多指点，我将十分感谢！
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 可能是样品本身的问题
2 抗体的问题，看看一抗有没有失效，二抗用的是不是和一抗相匹配的抗体。比如一抗用的是mouse的，二抗必须用anti－mouse的，用其它的肯定不行
3 圆形发白的空泡应该是转膜过程中产生的气泡，下次转膜保证胶和膜之间没有气泡才行
4 另外，marker有条带是说X光片上还是膜上？如果是X光片，这个结果也不太好，显影液灵敏度太高了
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发表于 2014-4-5 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的抗体都是新买的,一抗是sigma的,mouse的，二抗中杉的，goat-anti-mouse的。marker在X光片上显的影。如果一抗二抗过程出现问题，Marker在正常情况下是不是不应该在X光片上显出条带？我该怎样做来改进我的实验呢？急啊！十分感谢！
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大



一般情况下，一抗不会识别marker，所以曝光的是时候marker不会显色在X光片上。但是如果你用的显色液灵敏度特别高，比如pierce的强显，压片子的时候时间又比较长，是可以到X光片的。
1.你的marker是不是预染的？如果是预染的，转膜可以转到膜上，说明转膜没有问题，顶多根据蛋白分子量大小优化一下条件。
2.或者洗膜的时候是不是tween浓度是不是太高，洗的时间又比较长，导致样品被洗掉了？如果排除了这两种情况，就是样品的问题了。
3.你的一抗稀释比例多大？建议做个抗体检测，摸一下最佳反应浓度，也可以看看抗体有没有问题。
建议你把详细的试验步骤和试验条件贴出来，这样大家才能帮你找到问题出在哪里。

[ 本帖最后由 tangxin_80 于 2014-4-5 17:16 编辑 ]
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发表于 2014-4-5 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我使用的是Bio-Rad的mini型电泳和转膜仪器。
1、75％酒精洗板
2、10％的分离胶和聚集胶（实验中聚集胶配好后几分钟就在烧杯中形成胶状，我又重新配的，这几天这种情况发生两次了。？）
3、样品没定量，我刚做WB,想摸下条件，所以检测Actin.上样量5－25μl ，预染的Marker，10μl。
4、电泳200v 1小时
5、转膜100v 1小时
6、TTBS洗5分钟
7、伊利高蛋白脱脂高钙奶粉封闭1小时
8、DDW洗3次后TTBS洗10分钟 3次
9、1：5000鼠的beta-actin抗体 4℃过夜（sigma公司）1：8000也没出actin的条带
10、DDw洗膜3次TTBS洗10分钟3次（摇床）
11、HRP标记的goat-anti-mouse IgG摇床室温孵育1小时
12、DDW洗3次后TTBS洗10分钟 3次
13、ECL（pierce 公司）反应5分钟
14、曝光1分钟
15、显影1分钟，定影
以上是我的实验步骤，可结果是上面的，请高手多多指教，感谢！
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 小中大
DDw是什么东西？
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 小中大
我知道了，双蒸水
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tangxin_80[使用道具]
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 小中大

有些地方看不太明白，说说我的看法吧
1 电泳 200V跑到底了吗？电压太高了，一般都是80V跑浓缩胶，120V左右跑分离胶。这么大的电压蛋白好像很难浓缩吧？
2 不知道你们用的预染marker是哪个公司的，感觉上样量有点高了，我们都是上2微升。marker上样量这么高，加上后来曝光时间相对来说较短，如果目的蛋白丰度不高，有可能会导致样品压不到目的条带。
3 ECL反应时间有些久，降低到1－2分钟足够了。还有必须要注意的就是取加示液时一定要换枪头，要不然两瓶混和以后，剩下的显影液再用荧光很容易发生萃灭。你得先确认一下有没有这个操作上的问题。
4 DDw洗膜好像没必要，可以去掉。TTBS中tween－20浓度是多大的？
5 排除了以上4种因素，曝光一分钟还压不到就延长压片时间，10min。再压不到就是样品问题了。
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tangxin_80[使用道具]
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 小中大

你说的10%的分离胶和聚集胶，聚集胶也是10％？？如果是的话肯定不对
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mercedes[使用道具]
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 小中大

1、我用的都是10%的胶,为什么不对呀?应该怎样做呢?
2、后来我电泳用20mA跑浓缩胶，30MA跑分离胶，marker是pierce公司的，建议上样量是10微升，我用5微升时X光片上就没有显影了，但目的条带还是没有
3、加ECL时我换枪头了，这没问题的
4、我压片压过5分钟，没有条带，没压过10分钟的。
5、我可以通过蛋白定量来看一下蛋白是不是降解了呢？因为我用的是匀浆过的在－80冰箱储存了约有一年的样品，我怀疑蛋白可能降解了。
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