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pET 载体的应用多种多样。例如分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是，能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的组合以便找到最佳条件，是非常值得的。任何有关目的蛋白的信息都有助于选择合适的载体。例如，有些蛋白表现活性要求一端或两端均无外源序列。
大多数pET 载体可以克隆非融合序列；但是，如果特定翻译起始序列在E. coli 中不能被有效使用，表达水平也会受到一定的影响。在这种情况下，通常是构建一种带有高效表达的氨基末端序列的融合蛋白(参见pET 载体特点总表，第7页，N端融合表达)，并在纯化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。不需连接反应的克隆(LIC)在这种情况中特别有用，可以通过肠激酶或Xa因子切去所有载体编码的氨基末端序列.不同的克隆策略、对限制性酶切位点及阅读框的不同要求，会影响对载体的选择。许多pET 载体具有同样的限制性酶切位点，用户可以仅准备一次目的插入片段，将其插入到多个载体中。
不同的要求可以考虑采用不同的PCR 克隆策略。LIC载体试剂盒是一种非常有用的产品，可以用来以PCR 制备插入片段却避免了限制性酶切消化载体和插入序列的操作。所有pET 翻译载体在克隆和标签区域后以3 种阅读框形式提供翻译终止密码子以及下游T7 转录终止子。终止子对于大多数蛋白的高效表达并非必要，但对于一些带有方向与目的基因一致的氨苄抗性基因(β-内酰胺酶) 的pET 质粒情况就不同了。如果T7 转录终止子在克隆时被去掉，就会出现随目的蛋白增加，IPTG 依赖的β-内酰胺酶(Mr 31.5 kDa)累积的情况，因为这时T7 RNA 聚合酶造成高效通读转录。
不同pET 载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。选用的克隆方式将决定这些“标签”或载体的附加氨基酸是否与目的蛋白一起融合表达。
