【求助】wb求助

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标题:【求助】wb求助

jkobn[使用道具]
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发表于 2014-4-5 20:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做wb的时候,条带出来过两次,现在连续三次做不出来了,跑胶跟转膜应该没有问题的,我用丽春红染色膜上的蛋白条带是有的,跟前几天做出来用的一抗,二抗,发光剂是一样的.一抗跟二抗的浓度也是一样的.为什么?请高手指点,谢谢!

jkobn[使用道具]
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发表于 2014-4-5 20:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哦,汇报清楚点,我原来做条带出来的时候:膜的正反面跟一抗的稀释液充分接触的(嘿嘿,浪费一抗比较多)；
条带不出来：只有膜的正面跟一抗稀释液接触（想省点一抗，我是用封口绞折好的跟膜膜差不多大少）其他的条件完全相同。这个有关系没？我实在想不出其他的理由了。郁闷中。
谢谢，战友的指点与帮助。等待中！

tie8[使用道具]
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发表于 2014-4-5 20:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

会不会是你显色时的问题，显色液还有暴光时的条件不好

jkobn[使用道具]
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发表于 2014-4-5 20:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我采用的是ECL法的,膜上加了发光剂后是暗室上看不到荧光的.
估计,显色液是没有问题的,是新配的.

jkobn[使用道具]
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发表于 2014-4-5 20:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天验证了我的二抗跟发光试剂是没有问题的.
我用500ul的ep管，5%的脱脂奶300ul加HRP标记的二抗0.2ul。加各100ul的发光试剂A,B液，在暗室是能看到很强的荧光的。时间有30分钟左右
哪位大侠指导！！谢谢！！

HP007[使用道具]
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发表于 2014-4-5 20:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=9885397&sty=1&tpg=1&age=0')

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发表于 2014-4-5 20:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的一抗可能有问题，我也碰到这种情况，后来换一抗就OK了

jkobn[使用道具]
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发表于 2014-4-5 21:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

换了一抗也不行，今天换了santa cruz 公司的一抗(goat anti rat)一抗浓度1：200，二抗(rabbit anti goat)北京博奥森公司浓度1:1000.跟以前做出来条带（附图），为什么呢？？请高手指点,谢谢！！！

[ 本帖最后由 jkobn 于 2014-4-5 21:01 编辑 ]

附件

2014-4-5 21:01

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mod=8048[使用道具]
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发表于 2014-4-5 21:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

正在做，关注中
我现在是存在杂带的问题
B-actin居然有三条带

喵咪[使用道具]
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发表于 2014-4-5 21:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

即然以前能做出来，转膜之前的条件应该没有问题，但建议重配一下电泳和电转缓冲液，排除一下这方面的问题；
从楼主的描述来看，二抗以后也没有问题，但我还是建议检测一下显、定影液的问题，可以拿一小段胶片在暗室内部分曝光后洗片，如能显影就可排除显、定影液问题；
上述问题都排除后，高度怀疑一抗的问题，换过抗体并不表示没有问题，以前我购买santa cruz 的一抗出问题后，换了几回一抗都有质量问题，跟中途运送的条件也有关系。

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